毛冬青基因组DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系的优化

摘要：

目的:优化毛冬青基因组DNA提取方法,建立稳定性高、重现性好、适合其遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系.方法:对比CTAB法、mCTAB法、SDS法、蛋白酶K法及植物基因组提取试剂盒的提取效果后,选择mCTAB法结合蛋白酶K法提取毛冬青基因组DNA,并优化了蛋白酶K用量.利用正交试验设计,对毛冬青ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2、dNTPs、Primer、DNA、Taq酶)进行优化,PCR结果使用SPSS16.0软件进行分析,基于优化后体系对哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物进行筛选,确定退火温度.结果:采用蛋白酶K-mCTAB法实现了4h内提取高纯度毛冬青基因组DNA,蛋白酶K用量为20 ng· mL-时DNA平均提取量较传统CTAB法提升9.5倍;毛冬青ISSR-PCR最终反应体系为Mg2+2.5 mmol·L-1,dNTPs 0.15 mmol·L-1,Primer 0.4μmol·L-1,DNA 70 ng,Taq酶0.5U.实验从100条引物中筛选出16条引物并确定退火温度,绘制出毛冬青ISSR指纹图谱.结论:蛋白酶K-mCTAB法适合毛冬青基因组DNA的提取,筛选出的反应体系、引物及退火温度能够满足毛冬青ISSR-PCR实验的要求.

关键词：毛冬青、DNA提取、反应体系优化、引物筛选

所属期刊栏目：18

分类号：Q94;R28

资助基金：国家科技支撑计划2012BAI29B09;公益性行业科研专项201407002

在线出版日期：2016-08-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：415-419