TNF-α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞自噬和增殖的影响及作用机制研究

摘要：

目的 观察TNF-α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASF)自噬和增殖的影响,并进一步通过抑制NF-κB通路来探讨这一影响的作用机制.方法 以RASF细胞株MH7A为研究对象,在一阶段实验中,根据5 ng/ml TNF-α处理的时间点不同,将细胞分为6组,即0、3、6、12、24及48 h组.在二阶段实验中,将细胞分为4组,即Bay组:细胞用5μg/ml Bay11-7082处理;TNF-α组:细胞用5 ng/ml TNF-α刺激;Bay+TNF-α组:细胞用5μg/ml Bay11-7082预处理2 h,再用5 ng/ml TNF-α刺激;正常对照(Ctrl)组:细胞不作处理.MTT法检测细胞相对活性;共聚焦显微镜下采用GFP-LC3来示踪自噬形成;Western blot法检测细胞内P-p65、自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3-I(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)以及唯Bcl-2同源-3域蛋白-1(Beclin-1)蛋白表达水平;Real time-PCR法检测细胞内Beclin-1 mRNA表达水平;细胞免疫荧光法检测P-p65在细胞中表达及定位.结果 与0 h组相比,12、24、48 h组细胞相对活性均明显升高(均P<0.05).GFP-LC3-Ⅱ腺病毒转染细胞后,与0 h组相比,TNF-α刺激滑膜细胞后自噬小体形成明显增多,其中24 h组最为明显.与0 h组相比,3、6、12 h组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),6、12、24、48 h组Beclin-1蛋白表达水平均明显升高(均P<0.05).与0 h组相比,6、12、24、48 h组Beclin-1 mRNA表达水平均明显升高(均P<0.05).与TNF-α组相比,Bay+TNF-α组细胞内P-p65蛋白表达及入核明显减少.与Ctrl组比较,Bay组细胞P-p65蛋白的表达水平明显下降,与TNF-α组比较,Bay+TNF-α组细胞P-p65蛋白的表达水平明显下降(均P<0.05).与Ctrl组比较,Bay组细胞相对活性明显降低(P<0.05);与TNF-α组比较,Bay+TNF-α组细胞相对活性明显降低(P<0.05).与TNF-α组相比,Bay+TNF-α组细胞自噬小体明显减少.与Ctrl组比较,Bay组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平均明显下降(均P<0.05);与TNF-α组比较,Bay+TNF-α组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平均明显下降(均P<0.05).与Ctrl组比较,Bay组Beclin-1 mRNA表达水平明显下降(P<0.05);与TNF-α组比较,Bay+TNF-α组Beclin-1 mRNA表达水平明显下降(P<0.05).结论 TNF-α能诱导RASF自噬和增殖活性,而NF-κB通路则能上调TNF-α刺激下的细胞自噬和增殖活性.

关键词：类风湿性关节炎;肿瘤坏死因子α;核因子-;κB;自噬;细胞增殖

所属期刊栏目：43

资助基金：浙江省自然科学基金联合基金资助项目;浙江省基础公益研究计划项目;台州市科技计划项目;国家大学生创新创业项目;浙江省大学生科技创新活动计划

在线出版日期：2021-09-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：1719-1723,1738,后插2