体外研究瞬时受体电位香草酸亚型1对缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制

摘要：

目的 初步探讨瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)对体外培养的缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制. 方法 取120只1～2d龄雌雄不拘C57BL/6小鼠,分离心脏培养原代心肌细胞,并进行如下实验,分组方法均按照随机数字表法.(1)将细胞分为常氧组及缺氧3、6、9h组,每组1孔.常氧组细胞行常规培养(下同),缺氧3、6、9h组细胞采用不含胎牛血清的DMEM无糖培养基于体积分数1％氧气、5％二氧化碳、94％氮气的低氧条件下分别培养3、6、9h.蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达.(2)将细胞分为常氧组和缺氧组,每组2张盖玻片,其中缺氧组细胞同前缺氧处理6h.免疫荧光法检测TRPV1的阳性表达.(3)将细胞分为4组,每组1孔.单纯缺氧组细胞同前行缺氧处理6h;缺氧+0.1μmol/L辣椒素组、缺氧+1.0 μmol/L辣椒素组、缺氧+10.0 μmol/L辣椒素组细胞分别加入0.1、1.0、10.0 μmol/L辣椒素处理30 min后,行缺氧处理6h.蛋白质印迹法检测LC3、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达.(4)将细胞分为5组,每组5孔.缺氧组细胞同前缺氧处理6h;缺氧+氯喹组、缺氧+辣椒素组、缺氧+辣椒素+氯喹组细胞分别加入50 μmol/L氯喹、10.0μmol/L辣椒素、50 μmol/L氯喹+10.0 μmol/L辣椒素处理30 min后缺氧处理6h.细胞计数试剂盒8法检测细胞活力.(5)将细胞分为单纯缺氧组及缺氧+10.0 μmol/L辣椒素组,每组1孔,前者细胞同前缺氧处理6h;后者细胞加入10.0μmol/L辣椒素处理30 min后,行缺氧处理6h.蛋白质印迹法检测溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)、LAMP-2的蛋白表达.各实验重复3次或5次.对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正. 结果 (1)与常氧组比较,缺氧3、6、9h组心肌细胞中LC3、Beclin-1、TRPV1蛋白表达明显增高(t3h=4.891、5.890、4.928,t6h=9.790、6.750、10.590,t9 h=6.948、6.764、5.049,P＜0.05或P＜0.01);缺氧6h组3种蛋白表达最高,分别为1.08 ±0.05、1.12±0.10、0.953 ±0.071.(2)缺氧组TRPV1在心肌细胞膜和胞内密度明显增加,呈团块状分布,表达明显强于常氧组.(3)与单纯缺氧组比较,缺氧+0.1 μmol/L辣椒素组心肌细胞中Beclin-1蛋白表达明显增高(t=10.488,P＜0.01),LC3和TRPV1蛋白表达虽增高但差异无统计学意义(t=4.372、3.026,P＞0.05);缺氧+1.0 μmol/L辣椒素组、缺氧+ 10.0 μmol/L辣椒素组心肌细胞中LC3和TRPV1、Beclin-1蛋白表达均明显增高(t=15.505、5.773、13.430,20.915、8.054、16.384,P＜0.05或P＜0.01),其中缺氧+10.0 μmol/L辣椒素组3种蛋白表达均达峰值,分别为2.33 ±0.09、1.34±0.07、1.246±0.053.(4)与常氧组(0.585 ±0.045)比较,缺氧组心肌细胞活力明显下降(0.471 ±0.037,t=4.365,P＜0.05);与缺氧组比较,缺氧+氯喹组心肌细胞活力进一步明显下降(0.350±0.023,t=6.216,P＜0.01),缺氧+辣椒素组心肌细胞活力则明显升高(0.564±0.047,t=3.489,P＜0.05);与缺氧+氯喹组比较,缺氧+辣椒素+氯喹组心肌细胞活力无明显变化(0.364±0.050,t=0.545,P＞0.05).(5)与单纯缺氧组(0.99±0.04、0.54 ±0.04)比较,缺氧+10.0 μmol/L辣椒素组心肌细胞中LAMP-1和LAMP-2蛋白表达明显增加(1.49 ±0.06、0.81 ±0.05,t=12.550、7.442,P＜0.01). 结论 TRPV1通过自噬-溶酶体途径进一步促进缺氧早期小鼠心肌细胞自噬相关蛋白的表达,增强自噬活性,改善自噬流,减轻早期缺氧心肌细胞的损伤.

关键词：自噬、缺氧、肌细胞、心脏、瞬时受体电位香草酸亚型1

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资助基金：国家自然科学基金重点项目81430042Key Program of National Natural Science Foundation of China 81430042

在线出版日期：2019-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：186-192