低免疫原性猪真皮支架制备及其细胞相容性评价

摘要：

目的 观察基质金属蛋白酶7(MMP-7)、京尼平及真空冷冻干燥处理对猪脱细胞网状层真皮基质组织结构及细胞相容性的影响. 方法 取清洁级健康大约克夏猪边腹部皮肤,采用机械法制作54块网状层真皮,面积10.0 mm ×5.0 mm,厚0.5～0.6mm,按随机数字表法分为正常对照组(A1组,不行处理)、脱细胞组(R组,行脱细胞处理)、脱细胞+ MMP-7组(C组,行脱细胞和MMP-7处理)、脱细胞+ MMP-7+京尼平组(D组,脱细胞处理后用MMP-7和京尼平处理)和脱细胞+MMP-7+京尼平+真空冷冻干燥组(E组,除行D组处理外,加真空冷冻干燥处理),A1组6块,其余毎组均为12块.另取6块相同面积人ADM设为人ADM组(A2组,不行处理),即细胞相容性实验中的对照组.采用HE染色、扫描电镜检测A1、B～E组真皮支架中细胞数量及组织结构变化,采用免疫组织化学染色法检测A1、B、C组样本中波形蛋白、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原蛋白残留情况,采用细胞毒性试验检测B～E组浸提液的细胞毒性.接种人Fb于B～E组和A2组真皮支架表面培养,观察培养3、7、14 d时 Fb生长情况,采用ELISA法检测培养3、7 d 上清液中IL-6、IL-8含量.对数据进行双因素方差分析及LSD-t检验. 结果 A1组可见含毛囊的浅黄包颗粒状结构,B组标本毛囊内仍有少量毛发、上皮根鞘、细胞核、细胞碎片样结构及波形蛋白、LN、Ⅳ型胶原蛋白残留,C～E组经MMP-7处理后上述物质被完全去除.大体观察显示,D、E组真皮支架韧性较B、C组增加.C ～E 组胶原纤维结构完整,排列与A1组相似且胶原纤维之间间隙增大,其中C、D组间隙相近但均大于B组,E组最大 .B～E组真皮支架浸提液细胞毒性为0或1级.Fb于A2和B～E组真皮支架上均能增殖,并且随培养时间延长逐渐由单层变成复层生长进而向标本内部生长.D、E组真皮表面细胞密度较高,A2、C组细胞则主要存在于组织内部.培养7 d,A2、B～E组培养上清液中IL-6含量分别为(132±14)、(104 ±9)、(122±14)、(120±12)、(128±17) pg/mL,IL-8含量分别为(135±18)、(102±17)、(127±18)、(134 ±23)、(141±24) pg/mL,分别较培养3d的(55±13)、(34±8)、(48±8)、(50±13)、(49±12)pg/mL和(93±19)、(63±11)、(82±15)、(82±16)、(89±16) pg/mL明显增高(F值分别为98.869、184.038、125.531、93.237、87.265和 15.694、23.451、22.801、19.607、1 8.808,P值均小于0.05)；同一时相点A2、B～E组组间IL-6、IL-8含量比较,差异均有统计学意义(F值分别为2.809、3.301 和3.757、3.266,P值均小于0.05)；LSD-t检验结果表明,A2、C～E组组间IL-6、IL-8含量比较差异无统汁学意义(t值分别为0.058 ～1.905、0.034 ～1.295,P值均大于0.05),但均较B组高(t值分别为3.707～ 5.612、2.785～4.079,P值均小于0.05).结论 脱细胞联合MMP-7、京尼平及真空冷冻干燥方法制备的低免疫原性猪真皮支架具有较好的细胞相容性,细胞长人组织内部较少可能与京尼平增加组织韧性有关.

关键词：基质金属蛋白酶7、细胞毒性试验、免疫、冷冻干燥法、脱细胞真皮基质、细胞相容性、京尼平

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分类号：O63;R783.1;R318.08

资助基金：山东省医药卫生科技发展计划;济南市留学人员创业计划

在线出版日期：2013-01-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：329-335