内毒素结合肽及其突变体的表达纯化和抗内毒素/脂多糖活性研究

摘要：

目的 使内毒素结合肽(EBP)及其突变体mEBP在E.coli DH5α中表达,纯化后鉴定其抗内毒素/脂多糖(LPS)活性.方法 (1)将含PinpointXa3-EBP及其突变体PinpointXa3-mEBP的工程菌DH5α活化,加入异丙硫半乳糖苷(IPTG)诱导其表达生物素融合蛋白.分离纯化表达产物,因子Xa酶切融合蛋白分离目的肽EBP和mEBP.采用亲和层析及反相高效液相色谱法纯化目的肽,用氨基末端10个氨基酸残基序列分析法鉴定突变体mEBP.(2)分离正常人外周血单核细胞(PBMC),用5 mg/L异硫氰酸荧光素(FITC)-LPS+不同浓度EBP或mEBP(均为2.0、5.0、12.5 mg/L)刺激PBMC,检测其平均荧光强度.用1 mg/L LPS+3种浓度(同前)EBP或mEBP刺激PBMC,5 h后取上清液,检测肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素(IL)6浓度.(3)将25只昆明小鼠分为正常对照组(5只):腹腔注射等渗盐水0.2 ml;模型组(5只):小鼠造成20%TBSAⅢ度烧伤,伤后腹腔注射LPS(1 mg/kg);治疗组(15只):小鼠同前致伤后,腹腔注射多黏菌素B(PMB,5 mg/kg)或EBP或mEBP(后两者均为10 mg/kg).6 h后检测各组小鼠血清TNF-α、IL-6浓度及肝组织中TNF-α mRNA的表达水平.结果 (1)纯化后的目的肽EBP、mEBP纯度均达98%以上,mEBP氨基末端10个氨基酸残基序列分析符合预期结果.(2)随着mEBP或EBP浓度的增加,PBMC表面的平均荧光强度逐渐减弱;且在同一浓度下,加入mEBP后平均荧光强度的减弱程度较加入EBP明显.与用1 mg/LLPS刺激PBMC比较,加入1 mg/L LPS+12.5 mg/L EBP以及1 mg/L LPS+3种浓度mEBP刺激后,PBMC培养上清液中IL-6及TNF-α的水平均明显降低(P＜0.01).(3)与模型组比较,治疗组小鼠血清IL-6、TNF-α水平均明显降低(P＜0.01),其中10 mg/kg mEBP治疗组两指标低于等浓度EBP治疗组(P＜0.05).(4)小鼠肝组织TNF-α mRNA表达水平:正常对照组相对灰度值为0.25,模型组为0.93,10 mg/kg mEBP治疗组为0.51,10 mg/kg EBP治疗组为0.77,5 mg/kg PMB治疗组为0.43.结论 具有抗LPS活性的小分子肽可通过原核表达获得;EBP及mEBP均具有抗LPS活性,其中mEBP拮抗作用更强.

关键词：基因表达、内毒素类、内毒素结合肽、突变体、纯化

所属期刊栏目：22

分类号：R3(基础医学)

在线出版日期：2006-09-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：291-295