一种实用的β-分泌酶表达、纯化和活性鉴定方法

摘要：

目的 探讨一种在常用真核细胞系中表达、纯化和鉴定阿尔茨海默病(AD)相关蛋白-β-分泌酶(BACE1)的方法. 方法 在从人脑基因库中获取BA CE1序列并成功扩增的基础上,将其插入带有增强绿色荧光蛋白(EGFP)的表达载体pEGFP-c3中.将BACE1/pEGFP-c3重组质粒用脂质体转染至HEK293细胞中表达,再通过TALON亲和色谱法分离纯化及酶切得到BACE1蛋白.用Western blotting及荧光共振能量共振转移(FRET)法鉴定BACE1的表达和体外活性.同时将BACE1/pEGFP-c3质粒与表达淀粉样前体蛋白(APP)的重组质粒(APP/pDsRed-Monomer-N1)共转染HEK293细胞,再以Western blotting法检测BACE1切割底物APP的效果. 结果 (1)实验获得的BA CE1基因与GenBank中的序列一致.(2)活性测定表明,空白对照组、标准BACE1阳性对照组、纯化的BACE1实验组的荧光强度分别为55.013 ±3.597、2639.548±207.190和1836.629±154.195,差异有统计学意义(F=78.681,P=0.000),其中后2组差异无统计学意义(P＞0.05).(3)Western blotting结果显示转染的BACE1在细胞内可切割底物APP并产生CTF-APP条带. 结论 本实验方法可成功获取BA CE1基因片段并在HEK293细胞中高效表达,同时具备生物学活性,可为AD临床药物的开发提供物质基础.

关键词：阿尔茨海默病、β-分泌酶、真核细胞

所属期刊栏目：14

分类号：R338(人体生理学)

资助基金：国家自然科学基金;广东省自然科学基金;广州市科技计划;国家级大学生创新创业训练计划项目

在线出版日期：2015-07-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：604-608