LRIG3特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

摘要：

目的 构建LRIG3(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 3,LRIG3)基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制LRIG3基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础.方法 根据GenBank数据库提供的LRIG3基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发卡RNA(shRNA)的DNA序列,命名为LRIG3-shRNA1、LRIG3-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为negative-shRNA.并与pGenesil2质粒载体连接,转化感受念大肠杆菌,挑选阳性克降,抽取重组质粒,使用限制性内切酶Sal Ⅰ酶切电泳,DNA测序鉴定.3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑选单克隆并扩增扶得稳定株.逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG3的表达.结果 重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经Sal Ⅰ酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确.G418筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil2-LRIG3-shRNA组细胞LRIG3mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative-shRNA组.结论 成功构建针对LRIG3基凶的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后町抑制LRIG3基凶表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础.

关键词：LRIG3基因、RNA干扰、脑胶质瘤细胞、载体构建

所属期刊栏目：8

分类号：R739.41(肿瘤学)

资助基金：国家自然科学基金资助项目30500521

在线出版日期：2009-06-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：122-126