伴放线放线杆菌cdtB基因克隆及其表达蛋白的体外生物学活性检测

摘要：

目的 体外构建伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)CdtB蛋白的原核表达载体并诱导其表达,通过变性、复性获得有Ⅰ型脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease Ⅰ,DNase Ⅰ)样活性的重组CdtB蛋白,为进一步研究AaCdtB的功能以及Aa细胞致死性扩张毒素三聚体全毒素在牙周炎发生、发展过程中的分子致病机制奠定基础.方法 以AaATCC29522基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)法获得cdtB基因,经双酶切、连接的定向克隆技术构建原核表达载体pET-15b-cdtB.转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导CdtB蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及蛋白质印迹法检测并鉴定蛋白表达.纯化的重组CdtB体外与超螺旋质粒(pET-32a)DNA孵育,观察其生物学活性.结果 经测序鉴定,构建的原核表达载体pET-15b-cdtB转染的感受态大肠杆菌携带有cdtB基因,该基因片段与GenBank中已收录的AacdtB基因序列一致性高达99%.SDS-PAGE观察到32 000左右的高表达蛋白条带,蛋白质印迹法发现带有6个组氨酸蛋白标签标记的目的 蛋白CdtB.超螺旋质粒DNA与CdtB体外孵育后发生了解螺旋现象.结论 本项研究成功构建了AaCdtB的原核表达载体并诱导CdtB蛋白的体外表达,获得了具有DNaseⅠ样活性的重组CdtB蛋白.

关键词：放线杆菌、伴放射菌、毒素类、生物学、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、基因克隆

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分类号：R78(口腔科学)

资助基金：国家自然科学基金30700942;江苏省高校自然科学基础研究面上项目07KJB320076;教育部留学回国人员科研启动基金2008

在线出版日期：2010-08-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：482-486