诱导多功能干细胞技术制备内皮细胞构建患者组织工程瓣膜的实验研究

摘要：

目的 探讨利用诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSc)技术重新编码人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast,HSF),诱导分化为内皮细胞(endothelial cell,EC)作为种子细胞;以及以脱细胞猪主动脉瓣膜作为支架,体外构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valve,TEHV)的可行性.方法 原代分离培养患者HSF细胞,制备携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC基因的慢病毒上清感染HSF细胞,观察感染后细胞形态变化.碱性磷酸酶(AP)染色、细胞免疫荧光染色检测鉴定产生的HSF-iPSc.随后用诱导培养液在体外定向分化HSF-iPSc,Western blot检测分化过程中中皮标志物的表达;分化结束后,流式细胞术分选C D31阳性细胞,细胞免疫荧光染色检测HSF-iPSc-EC标志物,吞噬实验和成管实验检测HSF-iPSc-EC的功能.制备脱细胞猪主动脉瓣支架,行HE染色和扫描电镜观察.种植HSF-iPSe-EC于主脉瓣支架构建TEHV,采取静-动-静的模式培养,行HE染色和扫描电镜观察,免疫荧光染色检测α-SMA表达.结果 原代HSF经编码后形态与胚胎干细胞类似,AP染色阳性,并表达多潜能标志物Nanog、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81.HSF-iPSc分化为EC过程中,内皮标志物CD31、VE-cad、vWF、eNOS不断上调.CD31阳性分选后获得的HSF-iPSc-EC均表达CD31、VE-cad、vWF、eNOS.同时,HSF-iPSc-EC具有明显的乙酰化LDL吞噬和成管能力.猪主动脉瓣膜细胞被完全脱去,且保留完整的纤维网状结构.构建的TEHV表面上内皮样细胞复层生长,排列有序且黏附良好.另外,种植的HSF-iPSc-EC呈空间特异性的表达α-SMA.结论 研究所得HSF-iPSc-EC可作为构建TEHV理想的种子细胞,初步实现了脱细胞主动脉瓣体外再内皮化的预期目标.

关键词：人皮肤成纤维细胞、诱导多功能干细胞、内皮细胞、组织工程心脏瓣膜

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资助基金：河南省卫生厅资助项目200903128

在线出版日期：2015-12-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：352-355,363