二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药的影响

摘要：

目的 探讨二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达上调对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞顺铂耐药的影响.方法 构建携带DHFR基因的重组慢病毒载体(即重组载体DHFR-pWPI),利用脂质体lipofectamine 2000将其转染至卵巢癌细胞系SKOV3细胞中.实验分为3组:转染组(转染重组载体DHFR-pWPI质粒)、阴性对照组(转染慢病毒载体pWPI质粒)、空白对照组(未转染任何质粒).(1)蛋白印迹(western blot)法检测3组SKOV3细胞中DHFR蛋白的表达;(2)流式细胞仪检测3组SKOV3细胞经不同浓度(2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml)顺铂作用不同时间(24、48、72 h)后的细胞凋亡率,以及经3组细胞各自的50％抑制浓度(IC50;分别为6.0、4.0、4.9μg/ml,下同)的顺铂作用不同时间(24、48、72 h)后的细胞周期比例;(3)高效液相色谱法检测3组SKOV3细胞经不同浓度(4.0、6.0、8.0 μg/ml)顺铂作用不同时间(24、48 h)后其细胞内顺铂浓度的变化;(4)透射电镜观察3组SKOV3细胞经各自的IC50的顺铂作用不同时间(24、48、72 h)后细胞超微结构的变化.结果 本研究成功构建携带DHFR基因的重组载体DHFR-pWPI并转染入SKOV3细胞.(1)western blot法检测显示,转染组细胞中DHFR蛋白表达水平为10.280±0.009,明显高于阴性对照组及空白对照组(分别为2.050±0.003、3.480±0.003;P＜0.01).(2)流式细胞仪检测显示,不同浓度(2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml)的顺铂作用24、48 h后,转染组细胞凋亡率均明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);而顺铂浓度为5.0、10.0 μg/ml作用72 h后,转染组细胞凋亡率则明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).3组细胞经各自IC50的顺铂作用24、48 h时,其细胞均以G0/G1期细胞为主,且转染组Go/G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);而作用72 h时,3组细胞均以G2/M、S期细胞为主,且转染组S期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01),G2/M期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01).(3)高效液相色谱法检测显示,顺铂浓度为4.0 μg/ml作用24、48 h后,以及顺铂浓度为6.0 μg/ml作用24 h后,转染组细胞内的顺铂浓度均明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01);而顺铂浓度为6.0 μg/ml作用48 h以及8.0 μg/ml的顺铂作用24、48 h后,转染组细胞内的顺铂浓度均明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).(4)透射电镜下观察,3组细胞经各自IC50的顺铂作用24、48 h后,转染组SKOV3细胞的微丝聚集,线粒体数量及结构改变明显,而空白对照组及阴性对照组细胞微丝少见,线粒体数量减少,但结构改变不明显;3组细胞均出现扩张的内质网,正常的细胞器少见.顺铂作用72 h后,转染组细胞未见微丝,核膜几乎完全消失,胞质内有白色囊状物质,线粒体结构基本消失,大部分细胞濒临死亡;而空白对照组及阴性对照组细胞可见微丝排列紊乱,核膜部分消失,核糖体大量聚集,进入明显的坏死阶段.结论 本研究采用慢病毒载体系统成功构建了携带DHFR基因的重组慢病毒载体,DHFR基因表达上调后卵巢癌SKOV3细胞的耐药性增加,其耐药性增加可能与微丝的聚集及线粒体的改变有一定的联系.

关键词：卵巢肿瘤、抗药性、多药、抗药性、肿瘤、二氢叶酸还原酶、基因表达调控

所属期刊栏目：50

分类号：R737.31;R3;Q7

资助基金：国家自然科学基金;国家高技术研究发展计划（863计划）;广西科学研究与技术开发计划

在线出版日期：2016-01-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：854-860