10.3969/j.issn.1008-0589.202008036
基于氧化石墨烯-SELEX技术对氟苯尼考核酸适配体的筛选及其结构分析
氟苯尼考(FFC)具有胚胎毒性,在食用动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全.为建立快速检测动物性食品中FFC残留的方法奠定基础,本研究根据引物设计原则,设计了上下游引物,根据引物序列构建长度为80 bp的随机单链寡核苷酸(ssDNA)文库,其3'端和5'端为固定的20 bp引物结合位点,中间为40 bp的随机序列.通过氧化石墨烯-富集配体系统进化技术(GO-SELEX)筛选,即将经过预处理的ssDNA文库与等摩尔量的FFC及氧化石墨烯(GO)沉淀共孵育.通过GO的π-π共轭键吸附未结合靶标FFC的ssDNA,已结合靶标的ssDNA(FFC-ssDNA)则留在上清液中,通过离心获得FFC-ssDNA复合物.将每一轮筛选的FFC-ssDNA复合物经离心、抽提、醇沉淀回收所得到的ssDNA做为模板进行PCR扩增,通过链霉亲和素将PCR产物的双链DNA(dsDNA)彻底裂解为单链,作为次级ssDNA文库进入下一轮筛选.每一轮的筛选均计算一次回收率,当回收率变化趋于稳定时,引入反筛选物氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP),以去除与FFC特异性结合较差的ssDNA.当回收率达到饱和,筛选停止.最终,根据回收率的计算结果共进行了 12轮核酸适配体的筛选,其中有10轮为正筛选,第7轮和第11轮为反筛选.PCR结果显示,经12轮筛选均得到了所需要的目的ssDNA片段.对第9轮和第12轮的筛选产物克隆并测序,共得到46条不同的核酸适配体序列.经对46条核苷酸序列的二级结构、自由能(ΔG)预测和亲缘性分析,最终得到A1、A26、A27、A31、B18、B28、B30、B37共8条候选核酸适配体.通过测定8条候选适配体的解离常数(Kd值)分析其与FFC的亲和性.结果显示,8条候选适配体的Kd值在11.811 nmol/L～54.097 nmol/L;利用相同浓度的FFC、CAP、TAP对其中亲和性较高的A26和B18进行特异性试验,结果表明两条核酸适配体均可以与FFC特异性结合,且B18与FFC的特异性结合作用更强,可作为FFC的特异性核酸适配体.本研究首次对FFC的核酸适配体进行SELEX筛选,为建立快速检测动物性食品中FFC残留方法奠定基础.
氧化石墨烯;氟苯尼考;核酸适配体;指数富集配体系统进化技术
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S851.4(动物医学（兽医学）)
新疆兵团科技局高新技术攻关项目2016AB014
2021-08-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共9页
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