miR-26a-5p/环腺苷酸反应元件结合蛋白1分子轴调控脂肪来源干细胞成骨分化的机制研究
目的 探讨miR-26a-5p通过调控环腺苷酸反应元件结合蛋白1(cAMP response element binding protein 1,CREB1)对脂肪来源干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)成骨分化的调控作用及其作用机制.方法 取4只3～4周龄雌性C57BL/6小鼠脂肪组织,采用消化分离法分离培养细胞并传代.经细胞形态学观察以及流式细胞仪检测鉴定其为ADSCs后,取第3代细胞行成骨分化诱导.于诱导培养0、3、7、14 d行茜素红染色观察细胞钙沉积,ALP活性检测,实时荧光定量PCR检测miR-26a-5p和CREB1 mRNA表达,Western blot 检测 CREB1 蛋白及其磷酸化(phospho-CREB1,p-CREB1)水平以及 p-CREB1/CREB1.经 starBase 数据库预测miR-26a-5p和CREB1存在靶向结合位点后,取HEK-293T细胞行双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系(以培养48 h后荧光素酶活性表示).最后将miR-26a-p inhibitor(实验组)及对应阴性对照(对照组)转染至ADSCs中,成骨诱导培养7、14 d同上法行茜素红染色观察、ALP活性检测以及Western blot检测[目的蛋白包括CREB1、p-CREB1、Runt 相关转录因子 2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)].结果 经鉴定分离培养细胞为ADSCs.随成骨诱导培养时间延长,ADSCs钙化结节增多、ALP活性增加(P＜0.05);细胞中miR-26a-5p相对表达量逐渐降低,而CREB1 mRNA及蛋白相对表达量、p-CREB1蛋白相对表达量升高,其中7、14 d与0 d差异有统计学意义(P＜0.05);p-CREB1/CREB1各时间点间差异均无统计学意义(P＞0.05).通过starBase数据库预测发现miR-26a-5p和CREB1具有靶向结合序列,双荧光素酶报告基因实验显示过表达miR-26a-5p可明显抑制CREB1野生型荧光素酶活性(P＜0.05).成骨诱导7、14 d,与对照组相比,实验组细胞钙化结节数量、ALP活性以及CREB1、p-CREB1、OCN、RUNX2蛋白相对表达量均增加,差异均有统计学意义(P＜0.05);两组p-CREB1/CREB1差异无统计学意义(P＞0.05).结论 通过敲降miR-26a-5p上调CREB1及其磷酸化水平,能促进ADSCs成骨分化.
miR-26a-5p、脂肪来源干细胞、成骨分化、环腺苷酸反应元件结合蛋白1、小鼠
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R781.4;R318.17;R681.1
福建省教育厅中青年教师教育科研项目;福建省泉州市科技计划项目;福建省中医药大学校管课题科研项目
2023-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共7页
615-621
