全反式维甲酸与VEGF联合应用诱导小鼠胚胎成纤维细胞定向成骨分化
目的 研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)与VEGF联合应用对于小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)定向成骨分化的影响.方法 取NIH孕鼠(孕12 ～ 15 d)子宫内的胎鼠,去掉头、心、肝等器官后,采用胰蛋白酶消化贴壁法分离培养MEFs.利用HEK-293细胞采用反复冻融法扩增重组腺病毒红色荧光蛋白(recombinant adenovirus-red fluorescent protein,Ad-RFP)及Ad-VEGF.采用ALP染色和ALP定量检测法检测单独ATRA或VEGF以及ATRA和VEGF联合应用培养MEFs第3、5天ALP活性变化.将第3～4代MEFs分为A、B、C、D4组,分别加入DMSO+Ad-RFP、ATRA、Ad-VEGF、ATRA+Ad-VEGF.实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测第3、7天成骨相关标志物ALP、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及成血管相关标志物VEGF、血管生成素1(angiopoietin 1,ANGPT1)、内皮黏蛋白(endomucin,EMCN) mRNA表达;免疫组织化学染色检测各组第3、5、7天OPN、VEGF蛋白表达;茜素红染色检测各组成骨诱导14、21d钙盐沉积水平.取15只4～6周龄无胸腺雌性裸鼠,随机分为3组,每组5只,分别于背侧与腹侧皮下注射经ATRA、Ad-VEGF、ATRA+Ad-VEGF处理后的MEFs.植入后5周行X线片观察、大体观察及组织学染色(Masson、HE及番红O-固绿染色),观察各组裸鼠体内异位成骨情况.结果 成功分离培养MEFs;扩增后的Ad-RFP及Ad-VEGF成功转染MEFs,转染效率约为50％和20％.ALP活性检测示,单独使用ATRA或VEGF均能增强MEFs中ALP活性,且ATRA作用较VEGF强;ATRA和VEGF联合使用较单独使用显著增强了MEFs中ALP活性(P＜0.05).qRT-PCR检测示,ATRA联合Ad-VEGF使用上调了早期成骨分化相关标志物ALP、OPN、Ⅰ型胶原mRNA相对表达量(P＜0.05);7d时成血管相关标志物VEGF、EMCN及ANGPT1 mRNA相对表达量有所上升(P＜0.05).免疫组织化学染色示,ATRA联合Ad-VEGF不仅增强了OPN蛋白表达,VEGF蛋白表达在第7天也有所增强.茜素红染色示,单独应用ATRA或Ad-VEGF诱导钙盐沉积作用较弱,二者联合应用明显增强了MEFs成骨晚期钙盐沉积的效应.裸鼠体内植入实验结果显示,X线片观察发现与其余两组相比,ATRA+Ad-VEGF组存在明显骨块,且骨块体积较大,组织学染色可见大量胶原及成熟骨小梁、骨基质形成以及胶原骨组织.结论 ATRA与VEGF联合应用能诱导MEFs定向成骨分化.
全反式维甲酸、VEGF、小鼠胚胎成纤维细胞、成骨分化、成血管
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R714.5;R329.26;S
国家自然科学基金U1601220
2020-05-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共10页
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