兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外三维培养的实验研究
目的 探讨兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外培养的可能性,寻找修复椎间盘退变的理想种子细胞和支架.方法 胰蛋白酶消化法提取6月龄新西兰大白兔纤维环细胞,培养至第3代,复合于KLD-12多肽制备KLD-12多肽/纤维环细胞凝胶.倒置显微镜观察凝胶内细胞形态变化;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖活性;钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色观察凝胶内活、死细胞,计算活细胞比率;阿尔新蓝法检测培养基中糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;免疫荧光染色观察Ⅱ型胶原分泌情况;实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测纤维环细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖(Aggrecan)基因表达情况.结果 复合于凝胶中的纤维环细胞呈圆形,少部分在凝胶边缘处贴壁的细胞呈多角形.CCK-8结果显示,细胞增殖活性随培养时间延长呈增加趋势,培养14 d活性显著高于其余各时间点(P＜0.05),且各时间点活性均显著高于空白凝胶对照组(P＜0.05).Calcein-AM/PI双荧光染色观察示,培养5、14 d凝胶内细胞活细胞比率分别89.32％±8.58％和97.81％±1.09％,比较差异无统计学意义(t=-1.962,P=0.097).GAG检测示,细胞中GAG含量随培养时间延长逐渐增加,8d达峰值,之后逐渐下降;培养5、8、11d时GAG含量显著高于2、14d时(P＜0.05).免疫荧光染色示细胞中Ⅱ型胶原正常分泌.RT-qPCR检测示,培养5、14 d凝胶内纤维环细胞均可见Ⅱ型胶原和Aggrecan基因表达,14 d时基因相对表达量均显著高于5d时(P＜0.05).结论 纤维环细胞能够在KLD-12多肽纳米纤维凝胶中正常生长增殖,主要细胞外基质成分可正常表达,细胞生物活性良好.
椎间盘退变、组织工程、纤维环细胞、KLD-12多肽、兔
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R737.9;R318.08;R965.3
2016-04-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
303-308
