抗肌萎缩蛋白微基因转染C57/BL10小鼠成肌细胞的实验研究
目的 研究抗肌萎缩蛋白微基因(micro-dystrophin)体外转染成肌细胞后的表达,探讨成肌细胞移植联合基因治疗Duchenne型肌营养不良症的可行性.方法 制备感受态大肠杆菌JM109,将pSL139质粒转化感受态大肠杆菌,挑取阳性克隆菌落,培养过夜后按碱裂解法提取质粒,并用Pvu Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切后琼脂糖凝胶电泳.取5～7天龄C57/BL10雄性小鼠10只,体重4～5 g,采用多步酶消化与差速贴壁法行成肌细胞原代和传代培养,采用结蛋白(Desmin)免疫荧光检测鉴定.以pSL139质粒转染第3代成肌细胞为实验组,未转染为对照组.转染48 h后行RT-PCR检测和细胞免疫荧光检测两组成肌细胞内micro-dystrophin mRNA和蛋白的表达,并计算转染效率.结果 pSL139质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳40 min,即观察到3.75 kb的目的 基因和载体部分.倒置相差显微镜观察示,培养24～48 h后细胞完全贴壁,形态为三角形或菱形,大小基本一致:4～6 d后细胞生长至融合,可以传代.第2代成肌细胞爬片经Desmin免疫荧光检测,多数细胞胞浆可见绿色荧光,纯度在90%以上.pSL139质粒转染成肌细胞48 h后,RT-PCR检测示实验组和对照组成肌细胞cDNA在300 bp左右均出现条带,且实验组条带亮度高于对照组.细胞免疫荧光检测显示实验组部分成肌细胞胞浆中有绿色荧光,micro-dystrophin阳性细胞表达效率为45%～55%,对照组成肌细胞胞浆中无绿色荧光.结论 脂质体能介导pSL139质粒转染成肌细胞并在其胞浆中转录和表达.
成肌细胞、抗肌萎缩蛋白微基因、转染、细胞移植、小鼠
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R746.2;Q813.3(神经病学与精神病学)
国家自然科学基金30200085
2010-10-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
977-981
