10.3760/cma.j.cn121430-20220705-00634
基于髓样分化蛋白-2靶点探讨熊果酸抗脓毒症的作用机制
目的:以髓样分化蛋白-2（MD-2）为研究载体，探讨熊果酸抗脓毒症的作用机制。方法:应用生物膜干涉技术测定熊果酸与MD-2的亲和力，基于分子对接技术测定熊果酸与MD-2的键合方式。RPMI 1640培养基培养巨噬细胞Raw 264.7，细胞密度达到80%~90%时进行传代培养，取第2代细胞进行实验，通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测8、40和100 mg/L熊果酸对细胞活性的影响。将细胞分为空白组、内毒素组（LPS 100 μg/L）和熊果酸组（加入8、40或100 mg/L熊果酸后给予100 μg/L LPS处理）。用酶联免疫吸附试验（ELISA）评价熊果酸对一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-6、IL-1β）等细胞因子释放的影响；反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）评价熊果酸对TNF-α、IL-6、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶2（COX-2）mRNA表达的影响；蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测熊果酸对内毒素-Toll样受体4/MD-2-核转录因子-κB（LPS-TLR4/MD-2-NF-κB）通路中蛋白表达的影响。结果:熊果酸可能进入MD-2的疏水性空腔，通过疏水键与MD-2的氨基酸残基结合表现出与蛋白的较高亲和力〔解离常数（KD）＝1.43×10
-4〕。随着熊果酸浓度升高，细胞活性略有降低，8、40和100 mg/L熊果酸处理的细胞活性分别为96.01%、94.32%和92.12%，与空白组（100%）比较差异均无统计学意义。与空白组比较，LPS组细胞因子水平明显升高；而8、40和100 mg/L熊果酸处理可使细胞因子水平显著下降，且浓度越高作用越明显〔100 mg/L熊果酸与LPS组比较：IL-1β（μmol/L）：38.018±0.675比111.324±1.262，IL-6（μmol/L）：35.052±1.664比115.255±5.392，TNF-α（μmol/L）：39.078±2.741比119.035±4.269，NO（μmol/L）：40.885±2.372比123.405±1.291，均
P<0.01〕。与空白组比较，LPS组TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2的mRNA表达均明显升高，LPS-TLR4/MD-2-NF-κB通路中MD-2、髓样分化因子88（MyD88）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）和iNOS的蛋白表达明显上调。与LPS组比较，100 mg/L熊果酸与MD-2蛋白作用，可使TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2的mRNA表达明显下降〔TNF-α（2
-ΔΔCt）：4.659±0.821比8.652±0.787，IL-6（2
-ΔΔCt）：4.296±0.802比11.132±1.615，IL-1β（2
-ΔΔCt）：4.482±1.224比11.758±1.324，iNOS（2
-ΔΔCt）：1.785±0.529比4.249±0.811，COX-2（2
-ΔΔCt）：5.591±1.586比16.953±1.651，均
P<0.01〕，并显著下调LPS-TLR4/MD-2-NF-κB通路中MD-2、MyD88、p-NF-κB p65和iNOS的蛋白表达（MD-2/β-actin：0.191±0.038比0.704±0.049，MyD88/β-actin：0.470±0.042比0.875±0.058，p-NF-κB p65/β-actin：0.178±0.012比0.571±0.012，iNOS/β-actin：0.247±0.035比0.549±0.033，均
P<0.01）。但3组间NF-κB p65的蛋白表达差异无统计学意义。
结论:熊果酸抑制细胞因子和介质的释放及表达，通过阻断MD-2蛋白调控LPS-TLR4/MD-2-NF-κB信号通路，从而起到抗脓毒症的作用。
熊果酸、髓样分化蛋白-2、脓毒症、内毒素-Toll样受体4/髓样分化蛋白-2-核转录因子-κB信号通路、作用机制
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国家自然科学基金青年科学基金81303205;辽宁省应用基础研究计划项目2022JH2/101300081;辽宁省教育厅科学研究经费项目LJKZ0897;Youth Science Foundation of the National Natural Science Foundation of China81303205;Basic Research Plan Project of Liaoning Provincial Department of Science and Technology of China2022JH2/101300081;Scientific Research Fund Project of Liaoning Provincial Department of Education of ChinaLJKZ0897
2023-07-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共6页
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