脓毒症细菌内毒素诱导血管内皮细胞损伤与Toll样受体和钙信号的相关性研究

摘要：

目的 探讨Toll样受体4(TLR4)、髓质分化蛋白2(MD2)、基质相互作用蛋白1(STIM1)对细菌内毒素(LPS)诱导血管内皮细胞钙超载损伤及炎症反应的影响.方法 DMEM培养基培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC).① 高保真反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测LPS刺激前及刺激后0.5、1、6、12、24 h的TLR4、MD2、核转录因子-κB(NF-κB)表达.② 用psiSTIM、psiTLR转染细胞,激光共聚焦检测其对LPS刺激HUVEC钙内流的影响.③psiTLR转染12 h后用LPS刺激6 h,免疫共沉淀法检测抗TLR4抗体沉淀细胞裂解液中MD-2、STIM1、NF-κB蛋白表达.④ 在LPS刺激HUVEC基础上,给予NF-κB抑制剂PDTC 0.1 mg/L或1 mg/L以及转染psiTLR表达载体1 h或12 h,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平,RT-PCR检测STIM1、NF-κB的mRNA表达.结果 ①LPS刺激HUVEC后,上清液中TLR4、MD2、NF-κB的mRNA表达水平(2-ΔΔCt)逐渐升高,均于6 h达峰值,分别为23.52±2.88、17.43±3.43、18.13±2.99;与LPS刺激前(分别为7.02±2.81、5.19±3.22、8.11±1.42)比较差异均有统计学意义(均P<0.05).②psiSTIM可显著抑制LPS诱导细胞外钙离子内流峰值(Peak[Ca2+])显著升高(nmol/L:62.61±14.12比108.13±22.33,P<0.05);psiTLR也可显著抑制LPS诱导Peak[Ca2+]显著升高(nmol/L:50.78±8.05比109.43±20.21,P<0.01);而共同抑制TLR、STIM1表达则可使Peak[Ca2+]进一步降低(nmol/L:39.31±6.42比109.43±20.21,P<0.01).③ 非LPS处理组免疫共沉淀法能检测到抗TLR4抗体沉淀细胞中MD2蛋白表达,LPS处理组MD2蛋白表达增强,psiTLR+LPS组MD2蛋白表达显著减弱;而3组均未检测到STIM1、NF-κB蛋白表达.④ 与LPS组比较,PDTC 1 mg/L组TNF-α水平显著降低(ng/L:0.60±0.24比1.77±0.66,P<0.01),PDTC 0.1 mg/L和1 mg/L组及psiTLR 12 h组IL-6水平显著降低(ng/L:232.10±63.54、134.32±37.23、284.23±56.14比510.22±89.23,均P<0.05),PDTC 1 mg/L组和psiTLR 12 h组NF-κB、STIM1的mRNA表达水平均明显下降〔NF-κB mRNA(2-ΔΔCt):17.22±2.35、13.24±3.54比30.16±2.06,STIM1 mRNA(2-ΔΔCt):12.57±2.43、12.21±2.46比25.12±2.02,均P<0.05〕.结论 TLR4、MD2、NF-κB信号及STIM1可调节LPS刺激HUVEC细胞Ca2+内流及炎性介质水平;下调TLR4、NF-κB、STIM1能有效抑制LPS诱导血管内皮细胞钙超载损伤及炎症反应.

关键词：Toll样受体4、核转录因子-κB、基质相互作用蛋白1、髓质分化蛋白2、脓毒症、钙超载、血管内皮细胞

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分类号：R77;S85

资助基金：国家自然科学基金81272088;海南省重点科技合作项目ZDYF2016203 National Natural Science Foundation of China81272088;Key Scientific Cooperation Project of Hainan ProvinceZDYF2016203

在线出版日期：2017-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：150-155