富氢液对脂多糖刺激离体肠上皮 屏障功能障碍的影响

摘要：

目的：观察富氢液对脂多糖（LPS）刺激人肠上皮细胞（Caco2）单层模型细胞通透性的影响，探讨其对肠屏障功能障碍的保护作用机制。方法人结肠腺癌细胞株Caco2培养于含20%胎牛血清的DMEM培养基中，传代至第28～35代的细胞用于实验。采用随机数字表法将细胞分为空白组、富氢液组、LPS组和LPS+富氢液组。空白组和LPS组用正常培养基培养，富氢液组和LPS+富氢液组用含饱和氢气培养基培养；LPS组和LPS+富氢液组分别加入1g/L的LPS孵育，空白组和富氢液组加入等量生理盐水。建立Caco2细胞单层模型模拟离体肠上皮屏障，孵育0、3、6、12、24、48h测定其跨上皮细胞电阻（TEER）值来反映肠屏障通透性；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法和乳酸脱氢酶（LDH）法分别测定细胞活性和损伤情况；孵育6、12、24h采用蛋白质免疫印迹试验（WesternBlot）测定细胞紧密连接蛋白claudin-1与occludin的蛋白表达；孵育24h采用免疫荧光法观察claudin-1与occludin蛋白的分布。结果空白组与富氢液组各指标比较差异均无统计学意义。LPS组和LPS+富氢液组细胞孵育6h起TEER值即较空白组明显降低，且呈时间依赖性；而LPS+富氢液组细胞孵育6h起TEER值明显高于LPS组。与空白组相比，LPS组细胞活性明显降低〔（67.2±7.9）%比（100.0±0.0）%，P＜0.05〕，细胞损伤明显〔LDH释放率：（38.5±2.1）%比（1.2±0.3）%， P＜0.05〕，孵育6、12、24h时claudin-1和occludin蛋白表达明显下调〔claudin-1（灰度值）：0.351±0.079、0.272±0.075、0.190±0.049比0.518±0.030，occludin（灰度值）：0.416±0.044、0.290±0.062、0.226±0.019比0.602±0.038，均P＜0.05〕，孵育24h时细胞claudin-1和occludin蛋白分布紊乱且连续性中断。与LPS组相比，LPS+富氢液组细胞活性部分恢复〔（88.8±7.4）%比（67.2±7.9）%，P＜0.05〕，细胞损伤减轻〔LDH释放率：（16.4±4.3）%比（38.5±2.1）%，P＜0.05〕，24h时claudin-1和occludin蛋白表达明显上调〔claudin-1（灰度值）：0.428±0.046比0.190±0.049，occludin（灰度值）：0.466±0.071比0.226±0.019，均P＜0.05〕，且分布形态的连续性与完整性部分恢复。结论富氢液能够有效改善LPS所致肠上皮细胞屏障功能障碍，其机制可能与调节肠上皮细胞活性、减轻细胞损伤以及改善紧密连接蛋白claudin-1、occludin的表达与分布有关。

关键词：富氢液、脓毒症、脂多糖、肠上皮细胞、肠屏障功能障碍、紧密连接蛋白

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分类号：TU9;TS9

资助基金：国家自然科学基金81071533，81101409，81372033；天津市应用基础及前沿技术研究计划11JCYBJC12900；天津市医药卫生科技基金2011KZ108@@@@ National Natural Science Foundation of China81071533, 81101409, 81372033;Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology11JCYBJC12900;Tianjin Foundation of Medicine and Health2011KZ108

在线出版日期：2016-05-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：230-234