稳定表达Cas9蛋白的BHK-21单克隆细胞系的建立与鉴定

摘要：

为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系.将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选,筛选5代后通过有限稀释法培养Cas9单克隆细胞,利用Western blot检测Cas9蛋白的表达.为获得Cas9活性强的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,根据紧密连接蛋白(OCLN)基因序列,设计针对OCLN基因的sgRNAs,构建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组质粒,测序鉴定后将lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组载体转染BHK-21-Cas9单克隆细胞系.使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,经过Western blot检测OCLN蛋白的表达.Western blot检测Cas9蛋白结果显示,共获得了 17株BHK-21-Cas9单克隆细胞系;测序结果显示,lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA载体构建成功,通过Western blot鉴定,有2株Cas9编辑效果好、具有高敲除效率的BHK-21单克隆细胞系.结果表明,本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系,可以用于CRISPR/Cas9敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选影响病毒感染和复制的功能基因提供了科学依据.

关键词：Cas9蛋白、BHK-21细胞系、慢病毒、紧密连接蛋白

所属期刊栏目：58

分类号：S855.3(动物医学（兽医学）)

资助基金：新疆维吾尔自治区国际合作项目;国家自然科学基金;国家自然科学基金;新疆维吾尔自治区百名博士引进计划项目

在线出版日期：2023-08-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：12-17