利用CRISPR/Cas9技术敲除TLR3基因及其影响NDV复制的研究

摘要：

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用.为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的mRNA水平.结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞.Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异.新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的mRNA含量在四个时间点均显著上调(P＜0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3.再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的mRNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P＜0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P＜0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制.TLR7和MDA5的mRNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P＜0.01),IFN-β和IFIT1的mRNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P＜0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用.上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义.

关键词：TLR3、MDCK、CRISPR/Cas9、新城疫病毒

所属期刊栏目：49

分类号：S852.659.5(动物医学（兽医学）)

资助基金：转基因生物新品种培育科技重大专项;实验室研究项目

在线出版日期：2019-10-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：1128-1135