端粒酶活性多重荧光定量PCR(Taqman探针)检测方法的建立及验证

摘要：

目的 建立端粒酶活性的多重荧光定量PCR(Taqman探针)检测方法,并进行验证.方法 针对端粒酶催化亚基(telomerase reverse transcriptase,TERT)的CDS序列设计特异性逆转录引物、2对定量引物及探针.优化反应体系中的逆转录引物(特异性逆转录引物和随机引物)及定量引物(2对定量引物探针单独及混合使用),与内参基因GAPDH引物和探针在单管中进行多重荧光定量PCR反应.用293T及MRC-5细胞分别制备端粒酶阳性标准品及阴性标准品,并验证方法的稳定性及精密性.采用建立的方法检测19份正常间充质细胞样本和32份乳腺癌细胞样本的端粒酶活性.结果 最佳反应体系为:以特异性逆转录引物合成的cDNA为模板,将TERT基因2对定量引物和探针混合后与内参基因GAPDH引物和探针在单管中进行多重荧光定量PCR反应.优化后大幅提高了体系的灵敏性,TERT荧光信号量(△Rn)增强了3倍.阳性标准品TERT基因扩增曲线正常,且与GAPDH基因之间的△Ct保持稳定;阴性标准品GAPDH基因扩增曲线正常,无TERT基因扩增曲线.反复冻融3及5次阳性标准品的TERT与GAPDH基因之间的△Ct与未冻融过的阳性标准品比较,差异较小;组内和组间精密性CV均＜1％.19份正常间充质细胞样本端粒酶活性均为阴性,32份乳腺癌细胞样本端粒酶活性均为阳性,两者TERT基因的Ct值差异有统计学意义(t=4.236,P＜0.001).结论 建立的端粒酶活性多重荧光定量PCR(Taqman探针)检测方法具有良好的稳定性及精密性,有望应用于肿瘤早期诊断和基因治疗.

关键词：端粒酶活性、多重荧光定量PCR法、端粒酶催化亚基、Taqman探针

所属期刊栏目：36

分类号：R34(人体生物化学、分子生物学)

资助基金：国家自然科学基金;国家重点研发计划

在线出版日期：2023-11-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1218-1223