HCV聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化及结构研究

摘要：

目的构建HCV聚合酶基因重组原核表达质粒,研究高效表达聚合酶蛋白的最适条件、表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件,同时分析其二级结构,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物创造条件.方法采用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性病人血清中扩增出HCV NS5b RNA聚合酶全长基因序列,构建原核表达载体.在多个载体中选取pET-30a作为表达载体,选择诱导表达条件.利用Ni2+金属离子螯和亲和层析将其纯化.同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究,对其相关的分子生物学参数和二级结构进行分析.结果测序及读码框架分析结果表明,按照上述技术路线得到了相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列.在最佳表达条件下,诱导表达融合蛋白(相对分子质量65000),其最高表达量为18.9%,纯度大于92.83%,Westem blot法检测,能与HCV NS5b单抗反应,证明其为NS5b蛋白.对其二级结构的分析表明,已获得了活性基团完整的HCV聚合酶.结论 HCV聚合酶的高效表达和纯化,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础.

关键词：丙型肝炎病毒、聚合酶、融合蛋白、原核表达、结构

所属期刊栏目：17

分类号：Q352

资助基金：国家高技术研究发展计划863计划2001234021

在线出版日期：2004-12-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：337-340