结核分枝杆菌PE22/PPE36融合蛋白对耻垢分枝杆菌表型及巨噬细胞功能影响的研究

摘要：

目的 将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)PE/PPE家族重组融合蛋白PE22/PPE36异源表达于耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis,Ms)后,探讨其对Ms表型及巨噬细胞功能的影响,分析其在Mtb感染过程中发挥的作用.方法 原核表达获取融合蛋白PE22/PPE36,纯化后免疫6～8周龄小鼠制备多克隆抗体;电击法构建重组菌Ms_PE22/PPE36及Ms_vec,并用所制备的多克隆抗体验证重组融合蛋白在Ms中的表达.将重组菌接种于2×YT培养基中观察其菌落形态及生长曲线;点板法及菌落计数法检测重组菌在H2O2、SDS、溶菌酶、NaNO2、低pH、饥饿等压力条件下的存活情况,以分析PE22/PPE36融合蛋白对Ms表型的影响;重组菌侵染巨噬细胞ANA-1及RAW 264.7后,流式细胞术检测ANA-1细胞凋亡率,ELISA法检测ANA-1细胞TNF-α及IL-6分泌量,Griess法检测ANA-1及RAW 264.7细胞NO分泌量并用通道抑制剂检测所涉及的通路,菌落计数法检测重组菌在ANA-1及RAW 264.7细胞内的存活情况.结果 与Ms_vec组相比,Ms_PE22/PPE36的菌落形态、生物膜形成及在溶菌酶、NaNO2、低pH等压力条件下的存活率差异无统计学意义(溶菌酶:t3 h=0.082,t6h=0.174,t9h=0.355;NaNO2:t3h=0.950,t6h=1.274;低 pH:t3h=1.869,t6h=1.119,t9h=0.091;均P＞0.05);在 H2O2、SDS 压力条件下存活率明显降低(H2O2:t6h=4.35,t8h=4.80;SDS:t4h=10.43,t6h=2.793;均 P＜0.05);而稳定期生长速率及在饥饿压力条件下的存活率明显增高(生长速率:t30h=5.39,t36h=2.55,t42h=3.48;饥饿:t=3.323;均P＜0.05);与Ms_vec感染组相比,Ms_PE22/PPE36组ANA-1细胞的早期凋亡率及TNF-a分泌量明显增加(早期凋亡:F=4.765;TNF-α:t24h=26.642,t48h=7.634;均 P＜0.05),IL-6 分泌量明显减少(t24 h=5.888,t48h=3.001;均 P＜0.05),ANA-1 及 RAW264.7 细胞 NO 分泌量明显增加(ANA-1:F12h=163.267,F24h=111.530,F48h=500.328;RAW 264.7:F12h=133.202,F24 h=718.436,F48h=1 434.9;均 P＜0.05),且可被通道抑制剂 Bay 11-7082、U0126 及 SB203580 明显抑制(ANA-1:tNF-κB=32.074;tERK=11.679;tp38=16.840;RAW 264.7:t NF-κB=119.112;均 P＜0.001);与 Ms_vec 相比,Ms_PE22/PPE36在ANA-1细胞内的存活率无明显变化(t48 h=0.327,t72 h=1.9 3 3,均P＞0.05),在RAW 264.7细胞内的存活率明显降低(t48h=5.509,t72h=5.417;均P＜0.05).结论 重组融合蛋白PE22/PPE36可改变Ms的表型并调控巨噬细胞的免疫应答.

关键词：结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、PE22/PPE36融合蛋白、巨噬细胞

所属期刊栏目：39

分类号：R378.91(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

在线出版日期：2023-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：523-532