2型猪链球菌低分子量酪氨酸磷酸酶的制备及酶学研究

摘要：

目的 表达纯化2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,SS2)低分子量酪氨酸磷酸酶(Low molecular weight protein tyrosine phosphatase,LMW-PTP),测定LMW-PTP磷酸酶活性并鉴定其酶活性位点,为后续的功能鉴定奠定基础.方法分别构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A和pET28a:LMW-PTPR39A,重组质粒转化E coil BL21(DE3),筛选阳性转化子,通过IPTG诱导表达后经SDS-PAGE鉴定表达产物.镍柱亲和层析纯化得到重组蛋白经Western blot鉴定,野生型LMW-PTP免疫新西兰兔制备兔多克隆抗体.以对硝基苯酚二钠六水(PNPP-Na)为底物检测重组蛋白的磷酸酶活性.结果成功构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A、pET28a:LMW-PTPR39A,在大肠杆菌中野生型和突变型LMW-PTP均以包涵体的形式存在,相对分子量为23 kDa,包涵体经镍柱纯化及透析复性获得纯度较高的野生型和突变型LMW-PTP.制备得到的抗LMW-PTP的兔多克隆抗体的效价为1:102400,且重组蛋白均能与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应.对野生型蛋白进行磷酸酶活性检测显示其具有酶活性,酶活为2.1 nmol/(min·μg),突变型LMW-PTPC33A、LMW-PTPR39A无磷酸酶活性.结论成功表达了具有磷酸酶活性的LMW-PTP,并鉴定出Cys33和Arg39是LMW-PTP的活性位点.为后续寻找LMW-PTP在2型猪链球菌致病过程中毒力相关的靶蛋白奠定了基础.

关键词：2型猪链球菌、低分子量酪氨酸磷酸酶、原核表达

所属期刊栏目：34

分类号：R378.1(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：国家自然科学基金81571965,81172794,81071317;江苏省自然科学基金项目BK20151091;江苏省333工程科研资助项目BRA2014363

在线出版日期：2018-08-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：588-594