夹心ELISA检测微小隐孢子虫抗原方法的建立及初步应用

摘要：

目的 建立检测隐孢子虫的夹心 ELISA方法.方法 本试验以纯化的抗隐孢子虫 IgG、IgY分别作为包被抗体和捕获抗体,棋盘滴定法确定夹心 ELISA的最适工作条件.用基于18SrRNA的PCR方法评估饱和蔗糖溶液、饱和食盐水漂浮和PBST洗涤剂洗涤3种方法预处理样品对夹心 ELISA检测效果的影响.结果 建立的夹心 ELISA 捕获抗体、抗原、检测抗体、酶标二抗最佳工作浓度分别是1:800、2.5 μg/mL、1:100和1:5000,最适捕获抗体包被、抗原抗体反应、酶标二抗反应条件分别为37 ℃作用1 h后4 ℃过夜、37 ℃作用30 min、45 min;最适终止条件是2 mol/L H2SO4,50 μL/孔;TMB室温显色10 min;特异性试验结果显示仅可以检出隐孢子虫抗原,而与常见肠道寄生的球虫卵囊、圆线虫和蛔虫虫卵无交叉反应.批间和批内变异系数均小于10%.3种方法前处理粪便用于 ELISA检测与 nested-PCR检测结果总符合率分别为95.83%、91.67%和83.33%,以饱和蔗糖溶液漂浮法处理检测样品的效果最佳.与爱德士的隐孢子虫检测试剂盒比较,结果显示,本方法敏感性低于爱德士试剂盒的最低检出量(6×103个/mL),整个试验过程比试剂盒多用15 min,但特异性和重复性均一致,且本试验方法更加经济实用.结论 该方法简便,快速,灵敏,可用于临床粪样中隐孢子虫病原检测或隐孢子虫流行病学调查研究.

关键词：隐孢子虫、双抗体夹心ELISA、检测

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分类号：S855.9(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家重点研发计划2016YFD0500707;河南省科技厅基础与前沿研究项目No.162300410166联合资助Support by the National Key Research and Development Program of China2016YFD0500707;the Fundamental and Advanced Project of Henan Province162300410166

在线出版日期：2018-05-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：230-235,247