问号钩端螺旋体colA基因产物胶原酶活性及其致病机制研究

摘要：

目的 了解不同问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群colA基因分布和序列保守性、表达产物胶原酶活性以及感染细胞时colA基因表达水平变化和产物分泌情况.方法 采用PCR及其产物测序法检测我国主要流行的7个问号钩体血清群代表株中colA基因并了解其序列保守性.构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株colA基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取表达的目的重组蛋白rColA.采用分光光度法检测rColA水解Ⅰ～ⅣV型天然胶原蛋白及Azocoll和Pz-肽合成底物能力并测定其Km和Keat值.采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测问号钩体赖株感染HUVEC、BEAS-2B、L 02、HEK293细胞时colA mRNA水平变化及ColA分泌情况.结果 不同血清群问号钩体均能扩增出全长colA基因片段,其核苷酸和氨基酸序列相似性高达99.4％～100％.所构建的colA基因表达系统能有效表达rColA.rColA能不同程度地水解上述6种底物,但水解Ⅲ型胶原蛋白能力最强(P＜0.05),其Km和Kcat值分别为2.16 mg/mL和35.6 h-1.问号钩体赖株感染各靶细胞时colA-mRNA水平显著升高(P＜0.01),问号钩体-细胞共培养物上清中可检出ColA.结论 问号钩体colA基因为序列保守、分布广泛的胶原酶编码基因,感染细胞时该基因产物表达上调并外分泌,从而在问号钩体感染宿主过程中发挥实际作用.

关键词：问号钩端螺旋体、colA基因、胶原酶、表达、分泌

所属期刊栏目：32

分类号：R377.5(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：the grants from the National Natural Science Foundation of China.81261160321 and 81171534;a grant from the Provincial National Natural Science Foundation of Zhejiang ProvinceLQ14H190001;国家自然科学基金81261160321和81171534;浙江省自然科学基金LQ14H190001

在线出版日期：2016-05-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：7-12