一种高效的葡萄球菌基因敲除方法的建立与应用

摘要：

目的 建立一种高效构建葡萄球菌基因敲除突变株的方法.方法 通过融合PCR将vraSR操纵子上、下游同源片段连接起来;通过基于位点特异性重组的Gateway克隆技术将融合PCR产物连接入温度敏感型穿梭质粒pKOR1,转化修饰缺陷型大肠杆菌DC10B,获得同源重组质粒pKOR1-vraSR;电转化表皮葡萄球菌RP62A株;在高温和氯霉素双重选择压力下,质粒通过第1次同源重组整合到表皮葡萄球菌染色体上;转移到无抗生素的培养基中继续培养,发生第2次同源重组;将菌液涂布于含1 μg/mL脱水四环素的培养基上进行反向筛选,那些未发生重组的整合菌株因表达必需基因secY的反义RNA而无法生存,最后,挑取菌落通过PCR进行鉴定.结果 成功构建了难以转化的表皮葡萄球菌RP62A株的vraSR基因敲除突变株.结论 利用大肠杆菌DC10B和穿梭质粒pKOR1对葡萄球菌进行基因敲除的方法简便高效,适用的范围更广泛.

关键词：基因敲除、葡萄球菌、反向选择、限制修饰系统

所属期刊栏目：31

分类号：R378.1(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：the Open Research Fund Program of Key Laboratory of Medical Molecular Virology,Ministry of Education and Health201406;the Research Fund of Anhui Province Key Laboratory of Biological Macro-molecules ResearchLAB201408;the Key Program of Educational Commission of Anhui Province of ChinaKJ2015A218;the Provincial Training Program of Innovation and Entrepreneurship for UndergraduatesAH201310368111;教育部医学分子病毒学重点实验室开放课题201406;安徽省重点实验室自助研究课题LAB201408;安徽省教育厅自然科学研究重点项目KJ2015A218;省级大学生创新创业训练计划AH201310368111

在线出版日期：2016-04-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：1098-1102