CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究

摘要：

目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值.方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断,将其先后克隆入pET-28a表达载体.优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6).制备兔多克隆抗体,建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以健康者血清为对照,检测170例结核患者血清的抗体.结果 重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致.融合蛋白在E.coli BL21 (DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40％.利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到95％以上.Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应.CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000,CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002 μg/mL,患者血清的最佳稀释度为1∶500.检测结果与临床诊断的符合率,ELISPOT＞ ELISA(rCFP10-ESAT6)＞ELISA (kit).结论 CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原,对结核的诊断具有重要参考价值.

关键词：结核分枝杆菌、CFP10-ESAT6、酶联免疫吸附试验(ELISA)

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分类号：R378.91(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：上海市卫生局面上基金20124467;国家自然科学基金青年基金31200108;十二五科技重大专项2013ZX10004-221和2013ZX10004221-004;the Shanghai Health Bureau General Project20124467;the National Natural Science Foundation of China31200108;the Twelfth-five Major Project from the Ministry of Science and Technology of China.2014ZX10004002-003-004 and 2012ZX10004-211

在线出版日期：2015-06-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：315-319