葡萄球菌肠毒素A基因真核表达系统的构建及其目的重组蛋白的鉴定

摘要：

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因、构建其真核表达系统及目的重组蛋白的表达情况.方法采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565菌株中扩增全长SEA,目的扩增片段T-A克隆后测序.经核酸内切酶酶切重组质粒pUCm-T-SEA获得的pUCm-T-SEA基因片段与真核表达载体pPIC9K连接.采用电融合法将重组真核载体pPIC9K-SEA转化入P.pastoris GS115株,构建成真核表达系统pPIC9K-SEA-P.pastorisGS115.采用含G418抑制剂的YPD琼脂平板和PCR筛选并鉴定pPIC9K-SEA-P.pastorisGS115.0.5%(v:v)甲醇诱导下,采用SDS-PAGE检查BMMY液体培养基上清中重组SEA(rSEA)的表达情况.结果可从S.aureusATCC13565株DNA中扩增获得SEA目的片段.与报道的SEA基因序列(GenBank No.:AP004828 and L22566)比较,所克隆的SEA基因核苷酸及氨基酸序列的相似性分别高达98.84%～100%和100%.在甲醇的诱导下,pPIC9K-SEA-P.pastorisGS115能表达在SDS-PAGE图谱位于预期位置的rSEA.结论我们成功地构建了能表达SEA的真核表达系统,为进一步分析SEA分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础.

机标关键词：葡萄球菌肠毒素、基因序列、真核表达系统、构建、重组蛋白、鉴定、recombinant proteins、identification of、staphylococcal enterotoxin A、eukaryotic expression、金黄色葡萄球菌、Staphylococcus aureus、expression vector、真核表达载体、扩增片段、克隆、DNA fragment、amino acids、液体培养基、核酸内切酶

所属期刊栏目：20

分类号：R3(基础医学)

资助基金：Science Reseach Plan of Zhejiang Province2003C34010

在线出版日期：2004-06-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：303-306,310