华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆和表达

摘要：

华支睾吸虫病严重危害着人们的身体健康,研制快速诊断试剂盒对于华支睾吸虫病的防治显得非常重要.目前,市场上销售的快速诊断试剂盒,其诊断抗原主要来自华支睾吸虫成虫的粗抗原,抗原敏感性高,特异性却不高,所以寻找并生产基因工程重组抗原有着非常重要的意义.半胱氨酸蛋白酶是一类含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶,多种寄生虫都能产生或分泌半胱氨酸蛋白酶,它对寄生虫的生存、发育以及在寄生虫与宿主的相互关系上均有着极其重要的作用.越来越多的科研工作者开始重视它的免疫诊断价值,本文研究的目的是为华支睾吸虫快速诊断试剂盒寻找基因工程重组抗原.我们根据已知华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因序列设计一对引物,用文库构建试剂盒提取总RNA,并反转录成cDNA,以cDNA为模板,通过PCR技术从cDNA中扩增出目的基因.PCR产物通过测序鉴定,用工具酶BamHI 和 XholI同时消化目的基因和pGEX-4T-1原核表达载体,消化后的产物用连接酶连接,构建成pGEX-4T-1-CP重组体,并将其转入Jm109大肠杆菌中.用PCR初步筛选阳性克隆,共获得阳性克隆8个,再用双酶切和测序进一步鉴定初步筛选的阳性克隆.挑取阳性克隆,37℃条件下用IPTG诱导重组体表达,表达产物通过SDS-PAGE电泳鉴定.通过上述实验,获得了一条与已知基因大小一致的目的基因,并成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-CP,且表达出与理论值相符的融合蛋白.在本次研究中,半胱氨酸蛋白酶基因已成功扩增、克隆和表达,获得了分子量为51kD的融合蛋白,这为我们下一步抗原性的鉴定提供了材料,为快速诊断试剂盒诊断抗原的研究奠定了基础.

关键词：华支睾吸虫、半胱氨酸蛋白酶、基因扩增、克隆、原核表达

所属期刊栏目：20

分类号：R383.2(医学寄生虫学)

资助基金：广东省自然科学基金;广东省科技厅科技计划2002B31005;广东省广州市科技攻关项目200223-E4022

在线出版日期：2004-04-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：173-176