荧光环介导等温扩增检测化脓性链球菌sdaB方法的建立

摘要：

目的 建立荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测化脓性链球菌毒力基因sdaB的方法.方法 根据GenBank公布的化脓性链球菌sdaB基因保守序列(GenBank:69901515),使用引物设计软件Primer Explorer V5.0获得LAMP引物.在LAMP体系中加入荧光染料,对引物、MgSO4、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate,dNTP)、Bst DNA 聚合酶的使用浓度进行了筛选,MgSO4浓度范围为 0～12 mmol/L、甜菜碱浓度范围为0～2.4 mol/L、dNTP浓度范围为0.2～2 μmol/L、上游内部引物(forward inner primer,FIP)和下游内部引物(backward inner primer,BIP)浓度范围为 0.2～2 μmol/L、上游外部引 物(forward outer primer,F3)和下游外部引物(back-ward outer primer,B3)浓度范围为0.2～0.4 μmol/L、Bst DNA聚合酶浓度范围为0.16～0.96 U/μL、荧光染料浓度范围为0.2～2 pmol/L.以优化后体系,在ABI7500实时荧光定量PCR分析仪上评估方法学特异性和最低检出限,检测了13种标准菌株包括A群链球菌、B群链球菌、C群链球菌、G群链球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、淋病奈瑟菌、嗜酸乳杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌,最后检测了103例临床样本.结果 反应体系以25 μL 为宜,包含 25 μmol/L荧光染料 0.8 μL、100 mmol/L MgSO41 μL、5 mol/L甜菜碱 6 pL、25 mmol/L dNTP 1.4 μL、20 μmol/L FIP和BIP各2μL、20 μmol/L F3和B3各0.5 μL、8 U/μL Bst DNA聚合酶1μL 和2μL模板,去离子水补足,63℃反应45 min即可完成;最低检出限为500 pg/μL;检测12株非化脓性链球菌株,均为阴性结果.103例临床样本结果与培养法比较,临床灵敏度为100.0％(16/16),特异性为96.6％(84/87).结论 本研究检测化脓性链球菌的特异性和灵敏度较好,且操作简单,能满足临床需求,适宜现场检测及基层推广.

关键词：化脓性链球菌、环介导等温扩增、毒力基因

所属期刊栏目：23

分类号：R446.5(诊断学)

在线出版日期：2023-08-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：870-874