猪SsMT-1A和SsMT-2A的原核表达及金属结合特性研究

摘要：

[目的]通过对猪(Sus Scrofa)金属硫蛋白1A(metallothionein-1A of S.Scrofa,SsMT-1A)和2A(Metallothionein-2A of S.Scrofa,SsMT-2A)的生物信息学分析、原核表达和纯化,研究它们与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性.为饲料中添加 Zn和 Cu在促进猪生产性能的作用机制研究提供理论基础.[方法]首先,从 NCBI中获得 SsMT-1A和 SsMT-2A的基因序列,利用ClustalX2 和ExPASy分析两者的蛋白序列和结构差异,利用MEGA-X构建两者与其他物种MT蛋白分子的进化树.其次,构建pET-28a-SUMO-SsMT-1A/SsMT-2A原核表达载体,转化BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达.利用Ni-NTA柱亲和层析和葡聚糖凝胶层析纯化重组蛋白.最后,利用大肠杆菌金属耐受性实验、圆二色光谱(circular dichroism,CD)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser analytic ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和等温微量热仪(isothermal micrometer calorimetry,ITC)分析SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性.[结果]生物信息学分析表明:SsMT-1A和SsMT-2A蛋白分子的同源性较高,半胱氨酸(Cysteine,Cys)含量和排列基序完全一致,仅有 8 个非Cys位点差异.经原核表达、Ni-NTA柱和Superdex-75柱纯化、SUMO酶酶切,成功获得了SsMT-1A和SsMT-2A.金属耐受性试验表明:与SsMT-2A相比,转SsMT-1A大肠杆菌具有较强的Zn和Cu耐受性.CD光谱表明:SsMT-1A和SsMT-2A均可与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合,两者均展示了Zn(Ⅱ)结合偏好性,然而,SsMT-1A较SsMT-2A具有较强的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合能力.MALDI-TOF-MS表明:apo-SsMT-1A和apo-SsMT-2A的分子量分别为 6 047.5 Da和 6 048 Da,SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合稳定,与Cu(Ⅰ)的结合不稳定.ITC表明:SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合不稳定,与Cu(Ⅰ)的结合稳定,两者结合Cu(Ⅰ)的化学计量数均为 7,SsMT-1A结合 Zn(Ⅱ)的化学计量数为 2.[结论]虽然 SsMT-1A和 SsMT-2A具有较高的同源性,然而,8 个非Cys位点的差异决定了两者金属结合特性的差别.尽管SsMT-1A和SsMT-2A共享了高度一致的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合行为,然而,两者与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性存在细微差别,两者不应被认为是完全生理等价分子.在生理条件下:SsMT-1A可能发挥重金属离子的解毒作用,SsMT-2A可能发挥 Zn内稳态的调控作用.本研究为进一步阐明SsMT-1A和SsMT-2A调节金属离子内稳态,发挥促进猪生产性能的作用研究奠定了基础.

关键词：猪、金属硫蛋白-1A、金属硫蛋白-2A、生物信息学分析、原核表达、金属结合特性

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分类号：R746.1;R446.5;S831.5

资助基金：山西省基础研究计划项目;山西省高等学校科技创新项目;山西农业大学科技创新基金博士科研启动项目;山西省优秀博士来晋工作奖励资金科研项目;山西省科技创新人才团队专项

在线出版日期：2023-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共18页

页码：3461-3478