牦牛早期胚胎核旁斑点形成及对后续发育的影响

摘要：

[目的 ]明确牦牛早期胚胎发育过程中核旁斑点形成的关键时期,确定其参与形成长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNAs),探索核旁斑点形成对后续胚胎发育能力的影响及调控机制.[方法]体外受精生产牦牛胚胎,DAPI染色标记结合核旁斑点结构蛋白 1(paraspeckle Protein 1,PSPC1)mRNA 实时荧光定量 PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测确定牦牛早期胚胎发育核旁斑点形成关键时期,免疫荧光技术验证胚胎PSPC1蛋白表达水平;qRT-PCR检测核旁斑点形成相关 LncRNAs 核旁斑点组装转录因子 1(encoding nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)、共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶 1(coactivator associated arginine methyl transferase 1,CARM1)及 54 kD 核结合蛋白(non-POU domain containing octamer-binding protein,p54nrb)mRNA 在各时期胚胎中表达水平;RNA 干扰技术抑制合子PSPC1 mRNA水平,比较后续各阶段胚胎发育率,通过分析囊胚细胞总数、滋养层细胞数(trophoblast cells,TE)、内细胞团数(inner cell mass,ICM)评估囊胚质量;检测对照组和PSPC1 mRNA干扰组囊胚中B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B-cel l lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和 B 细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白 x(B-cel l l ymphoma/l eukemia associatedx protein,Bax)表达水平.[结果](1)在不同发育阶段胚胎细胞的细胞核均可观察到核旁斑点,但2-细胞和4-细胞时期胚胎细胞核中核旁斑点更为清晰,2-细胞至桑椹胚阶段PSPC1mRNA呈现高水平表达,其中4-细胞到桑椹胚阶段PSPC1 mRNA水平最高,PSPC1蛋白荧光强度在此阶段最强.(2)NEAT1、CARM1及p54n1rb mRNA均在2-细胞到桑椹胚阶段呈现高水平表达,其中NEAT1和p54nrb在4细胞时期水平最高,CARM1在2-细胞到桑椹胚3个阶段表达水平差异不显著(P＞0.05).(3)PSPC1mRNA干扰组桑椹胚与囊胚发育率均显著降低,且桑椹胚发育率降低幅度高于囊胚,PSPC1mRNA干扰组囊胚细胞总数显著低于对照组,其中以ICM细胞数降低为主,TE细胞数在两组之间差异不显著.(4)PSPC1 mRNA干扰处理组囊胚中促细胞凋亡因子BaxmRNA和蛋白均显著增加,抑凋亡相关因子Bcl-2mRNA和蛋白降低,且囊胚中内细胞团发生裂解.[结论]牦牛早期胚胎发育核旁斑点形成的关键时期为2-细胞至桑椹胚阶段,其中主要集中在4-细胞时期,且PSPC1、NEAT1、CRAM1、p54nrb在核旁斑点形成时期呈高水平表达.干扰牦牛合子PSPC1 mRNA导致后续胚胎发育能力降低,并通过诱导ICM凋亡降低囊胚质量,影响囊胚中细胞命运决定.

关键词：牦牛、核旁斑点、细胞命运、细胞凋亡、长链非编码RNA(LncRNAs)

所属期刊栏目：56

分类号：R714.5;R3;S

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金;甘肃省杰出青年基金;甘肃省教育厅创新创业能力提升项目;甘肃农业大学伏羲青年英才基金;甘肃农业大学博士科研启动基金

在线出版日期：2023-04-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共15页

页码：1189-1203