人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

摘要：

[目的]分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据.[方法]利用CodonW和EMB0SS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子(LYZop22)和全局密码子(LYZop)分别进行优化.构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体(pGL3-LYZcw/op22/op)和人溶菌酶过表达载体(pcDNA-LYZcw/op22/op),将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞(BFFC)和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响.[结果]牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异.依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子(RSCU＞ 1.5)和7个低频密码子(RSCU＜ 0.5)对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析.荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子(LYZcw),翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍(P＜ 0.01)和1.30倍(P＞ 0.05);而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍(P＜ 0.01)和2.44倍(P＜ 0.01),说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量.实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍(P＜ 0.05)和1.5倍(P＞ 0.05),而LYZop则分别提高了22倍(P＜ 0.01)和17.8倍(P＜0.01),mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关.Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量.上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果.[结论]通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础.

关键词：人溶菌酶、牛乳蛋白基因、密码子优化、荧光素酶检测、实时荧光定量PCR、Western-blot

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资助基金：陕西省重点研发计划;国家重点研发计划

在线出版日期：2020-11-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共13页

页码：3805-3817