猪链球菌4型转录调控因子Ga1R的生物学特性

摘要：

[目的]研究分析猪链球菌4型(Streptococcus suis serotype 4,SS4)强毒株SH1510转录调控因子Ga1R基因的缺失对细菌生物学特性的影响,为进一步研究Ga1R对半乳糖代谢途径的调控及其致病机理提供理论依据.[方法]利用同源重组双交换的方法构建了SS4强毒株SH1510转录调控因子Ga1R基因缺失株SH1510△Ga1R,通过Ga1R基因内部扩增引物I1/I2进行缺失株初步筛选,进一步通过PCR和Western blotting鉴定缺失株SH1510△Ga1R.对亲本株SH1510和缺失株SH1510△Ga1R进行革兰氏染色以比较形态差异;配置基础培养基,分别加入葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖后培养细菌,绘制细菌生长曲线,比较细菌对不同糖的利用率;将亲本株和缺失株的菌液浓度分别调整为2.5× 109、5×108、1×108、2×107 CFU/mL,对BALB/c小鼠进行腹腔注射以观察小鼠致死率并使用Reed-Muench法计算菌株LD50.将浓度为2×107CFU/mL的亲本株和缺失株1∶1等体积混合后腹腔注射BALB/c小鼠,24 h后取脑、脾、血在氯霉素抗性和无抗性THB平板上进行细菌计数,比较细菌在小鼠体内的定植能力;并以健康猪的全血模仿体内环境,将亲本株和缺失株分别加入含有SS4抗血清的健康猪全血中,37℃孵育2h进行平板计数,比较细菌在全血中的存活能力.[结果]使用内部检测引物I1/I2做PCR,缺失株SH1510△Ga1R检测为阴性,进一步使用引物C1/C2、01/C2、02/C1、01/02鉴定缺失株SH1510△Ga1R,分别扩增出1 056、2 121、2 094、3 147 bp的片段,结果和预期相符.Western blotting鉴定结果表明亲本株SH1S10可与粗制Ga1R多抗兔血清发生特异性结合,在37 kD处出现单一条带,但缺失株SH1510△Ga1R没有条带出现.PCR和Westernblotting鉴定结果均表明缺失株SH1510△Ga1R已构建成功.亲本株和缺失株经革兰氏染色,光学显微镜下观察可见亲本株和缺失株均呈链状排列,长度相似,形态无显著差异.在葡萄糖和蔗糖作为唯一糖原的生长条件下,亲本株和缺失株的生长情况相仿,而当糖原为D-半乳糖时,缺失株的生长速率和OD600值明显低于亲本株.另外,从最高OD600值可以看出,猪链球菌SH1510对糖的利用率为葡萄糖＞蔗糖＞D-半乳糖.小鼠致病性试验中,亲本株和缺失株的LD50分别为1×108CFU和1.62×108CFU,缺失株对小鼠的致病性下降了1.62倍.体内竞争感染试验结果显示,缺失株在小鼠的脑、脾、血液中的细菌分离数均远低于亲本株,差异极显著(P＜0.01).全血存活试验表示,亲本株的存活率为35.2％,缺失株的存活率为27.3％,缺失株SH1510△Ga1R比亲本株SH1510在全血中的存活率显著下降(P＜0.05).[结论] Ga1R基因可促进猪链球菌4型对半乳糖的利用,同时对SH1510的毒力有直接或间接的调控作用.

关键词：猪链球菌4型、Ga1R、生物学特性、毒力

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资助基金：国家公益性行业农业科研专项经费201303041;江苏现代农业生猪产业技术体系JATS2018 259

在线出版日期：2019-11-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：3485-3494