慢病毒介导shRNA干扰MAT2A与MAT2B基因抑制猪肌内脂肪细胞分化

摘要：

[目的]腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT)在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAMe).通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响.[方法]无菌条件下采集3-7日龄小猪背最长肌,采用差速贴壁法分离猪肌内脂肪细胞.根据GenBank中猪MAT2A基因序列(Accession No.NM_001167650.1)和MAT2B基因序列(Accession No.NM_001142832.1),获得其CDS序列.利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTMRNAi Designer分别设计shRNA靶序列, 将合成的单链寡核苷酸退火形成双链,与经过BamH I和Xho I(TaKaRa)双酶切后的pLenti-Hl载体连接,转化,并提取质粒进行酶切和测序鉴定.采用X-tremeGENE-HP DNA转染试剂与测序成功的重组质粒以及包装质粒(CMV-△8.9和CMV-VSVG)共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并进行滴度测定.在猪原代脂肪细胞密度达到70％-80％时,侵染病毒;细胞密度融合时诱导分化.提取分化第8天的猪肌内脂肪细胞的RNA,按照反转录试剂盒操作说明进行反转录,合成eDNA第一链.采用primer primer 5软件设计MAT2A、MAT2B、PPARγ、aP2、CEBP/α、β-actin基因的定量引物,实时定量和Western blot试验检测MAT2A和MAT2B基因的干扰效率.油红0染色和实时定量鉴定MAT2A和MAT2B基因对猪肌内脂肪脂质积累的影响.[结果]酶切及测序证明重组慢病毒载体pLenti-H1-MAT2A/MAT2B构建成功;包装的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B病毒滴度分别为6.7×107和7×107 pfu/mL,侵染肌内脂肪细胞72 h后,可出现90％的绿色荧光蛋白(GFP),表明所包装的病毒可满足侵染猪前体肌内脂肪细胞需要.实时定量结果显示其显著抑制了MAT2A和MAT2B的mRNA水平表达,其干扰效率分别在70％和60％以上;进一步采用Western blot试验及蛋白分析表明,干扰MAT2A基因后,MAT2A蛋白表达水平降低40％左右,差异达到极显著水平(P＜0.01);干扰MAT2B基因后,MAT2B蛋白表达水平降低25％左右,差异达到显著水平(P＜0.05).油红0染色和吸光度定量结果显示,与sh-scramble对照组相比,干扰MAT2A和MAT2B基因后,脂滴聚积能力显著抑制猪肌内脂肪细胞脂质积累.实时定量结果显示,干扰MAT2A和MAT2B基因抑制成脂标志基因PPARγ,aP2及CEBP/α的表达.[结论]成功构建了猪MAT2A和MAT2B基因的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B干扰载体.获得的重组慢病毒感染细胞后,能有效降低猪肌内前体脂肪细胞内MAT2A和MAT2B基因的mRNA和蛋白水平表达;进一步试验证明,干扰MAT2A及MAT2B基因后,显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质积累以及成脂关键基因表达.

关键词：腺苷甲硫氨酸转移酶2A、腺苷甲硫氨酸转移酶2B、慢病毒、肌内脂肪细胞、猪

所属期刊栏目：52

资助基金：国家自然科学基金31702096;河南省教育厅项目18B230010;信阳农林学院校级科技创新团队CXTD-201701

在线出版日期：2019-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：2706-2715