家蚕热休克蛋白HSP60相互作用蛋白筛选与鉴定

摘要：

[目的]HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子.前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础.[方法]利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术(LC-MS/MS),首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白.最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用.并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位.[结果]免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP trans locase (ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongat ion factor 1-a lpha (EF1a)和HSP90.构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated(IP)用a-Flag抗体孵育,immunoblotting (IB)再用a-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达.而IB用a-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1a与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用.通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中.线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起.[结论]鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制.

关键词：家蚕、BmHSP60、相互作用蛋白、免疫共沉淀、BmANT1、BmHSP90

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资助基金：国家自然科学基金31872427;国家蚕桑产业技术体系CARS-18;中国博士后科学基金面上项目2018M633309;重庆市博士后特别资助项目XmT2018020

在线出版日期：2019-03-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：376-384