大豆GmLEA的分离及其在种子活力中的功能分析

摘要：

[目的]大豆(Glycine max(L.)Merr.)种子从发育成熟期(R6或R7期)开始具有活力,在此时期容易受到高温高湿胁迫,导致种子活力下降.通过对GmLEA的研究,揭示其高温高湿胁迫下的表达水平以及功能,为一步深入研究GmLEA在参与大豆种子活力形成及响应非生物胁迫等方面奠定基础.[方法]利用Primer Premier 5.0软件设计引物,以宁镇1号和湘豆3号叶片的cDNA为模板,分离大豆GmLEA的cDNA序列全长.通过NCBI网站BLAST对GmLEA同源性氨基酸序列进行搜索,使用MEGA 6.0和DNAMAN多重比对蛋白质序列,并采用MEGA 6.0的N-J算法构建进化树.通过酵母双杂交试验验证GmLEA与GmCDPKSK5在酵母体内的互作.构建亚细胞定位和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)载体,通过基因枪介导法转化烟草叶片分析GmLEA与GmCDPKSK5在烟草叶片细胞内的互作及其编码蛋白的亚细胞定位.利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对GmLEA的组织特异性表达及其在高温高湿胁迫下的表达进行分析.构建pBI121融合表达载体,通过农杆菌介导法获得3个纯合的T3代过表达拟南芥株系,对高温高湿胁迫下拟南芥的种子活力进行分析.[结果]获得大豆GmLEA的cDNA序列全长,该基因包含一个长1 377 bp的开放阅读框(0RF);且该基因所编码的蛋白定位在烟草叶片细胞的细胞膜上.酵母双杂交试验与双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,GmLEA与GmCDPKSK5分别在酵母体内与烟草叶片细胞的细胞膜上存在特异性互作.组织特异性分析结果表明,GmLEA主要在宁镇1号和湘豆3号2个品种发育和成熟的种子中表达.在湘豆3号种子发育过程中GmLEA的表达量呈先上升后下降的趋势,在开花后50d达最大值,在宁镇1号种子发育过程中该基因的表达量呈上升的趋势,在开花后60d达到最大值.高温高湿胁迫后,与对照相比,GmLEA在湘豆3号中96 h时下调表达,其余时间点均上调表达,在宁镇1号中,仅24 h时下调表达.GmLEA过表达拟南芥株系经高温高湿胁迫后的发芽势、发芽率及种子活力均显著(P＜0.01)高于野生型植株.[结论]GmLEA参与高温高湿胁迫下种子活力的形成,与GmCDPKSK5存在特异性互作,二者可能共同参与高温高湿胁迫下种子活力的形成.

关键词：大豆、GmLEA、GmCDPKSK5、高温高湿、种子活力

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资助基金：国家自然科学基金31671772,31371711;科技部国家重点研发计划2018YFD0100905

在线出版日期：2019-01-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：4397-4408