苹果赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的克隆及功能分析

摘要：

[目的]从‘苏帅’苹果(Malus domestica)中分离克隆赤霉素氧化酶基因MdGA20x8的开放阅读框(ORF),分析其序列特征及在苹果中的组织表达特异性,通过在烟草中过表达MdGA2ox8研究其对烟草生长发育的影响,为该基因功能分析及应用提供理论参考.[方法]采用RT-PCR方法从苹果中克隆出MdGA2ox8的ORF区.利用NCBI、DNAMAN和Pfam在线软件进行氨基酸序列比对和保守结构域分析;利用Expasy在线软件对MdGA2ox8氨基酸组成、分子量、等电点进行分析;利用SignalP和TMHMMServer V.2.0分别在线分析蛋白质的信号肽和预测蛋白质的跨膜结构域;利用MEGA 7.0软件构建系统进化树.采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测MdGA2ox8在苹果不同组织中的表达量.构建MdGA2ox8过表达载体,采用农杆菌介导的遗传转化技术将MdGA2ox8导入烟草中,获得具有潮霉素抗性的转基因烟草植株,通过GUS染色、基因组PCR和RT-PCR鉴定转基因阳性植株;将野生型和转基因烟草移栽后,在第一朵花开放时测定转基因烟草的株高、节间长度和叶片长宽比以及烟草叶片叶绿素含量,激素GA1和GA4含量,并通过RT-qPCR方法分析烟草中相关基因的表达水平.[结果]成功克隆并获得了长为1 122 bp的MdGA2ox8 ORF区,编码373个氨基酸残基,蛋白相对分子质量为42.8 kD,理论等电点为5.44,不稳定系数为49.73,具有GA2ox的保守结构域DIOX_N和20G-Fell_Oxy,但无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽,为非分泌蛋白.序列系统进化分析结果显示MdGA2ox8与白梨GA2ox8亲缘关系最近.RT-qPCR结果表明,MdGA2ox8在苹果各组织中差异表达,在花中的表达量最高,其次为老叶＞幼叶＞韧皮部,在木质部和幼果中几乎不表达.将MdGA2ox8转入模式植物烟草中,获得了5个转基因阳性株系.与野生型相比,过表达MdGA2oxo烟草植株GA4含量降低,GA1含量有所升高,其中野生型和转基因烟草GA1平均含量分别为1.26和1.75 ng·g-1,GA4平均含量分别为5.43和1.07 ng·g-1.与野生型相比,转基因烟草植株GA1和GA4总含量降低,使植株节间缩短、矮化以及花期推迟,其中野生型和转基因烟草植株平均高度分别为38.50和7.36 cm,节间长度分别为9.5和3.3 cm;转基因烟草叶片颜色深绿,叶片长宽比降低.烟草内源赤霉素合成途径相关基因NtGA3ox1和NtGA3ox2的表达水平受MdGA2ox8的正反馈调节.[结论]获得苹果赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的开放阅读框,MdGA2ox8具有组织表达差异性.MdGA2ox8过表达烟草植株中GA1和GA4总含量降低,导致植株节间长度缩短、植株矮化.

关键词：苹果、赤霉素氧化酶、矮化、MdGA2ox8、过表达、烟草

所属期刊栏目：51

资助基金：国家自然科学基金3187110456;江苏省科学技术厅现代农业-重点及面上项目BE2017367

在线出版日期：2019-01-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共13页

页码：4339-4351