家蚕glial cell missing(BmGcm)基因鉴定、表达、亚细胞定位和功能

摘要：

[目的]鉴定、克隆家蚕(Bombyx mori)glial cell missing(BmGcm)基因,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征.制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究BmGcm功能打下基础.[方法]利用RACE方法克隆获得BmGcm全长cDNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对BmGcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析.采用RT-PCR和qRT-PCR方法检测BmGcm的表达情况.利用原核表达系统获得重组蛋白,通过蛋白纯化和免疫小鼠制备多克隆抗体,运用Western blot对抗体进行检测.构建BmGcm表达载体,转染家蚕胚胎细胞系,分析其亚细胞定位情况,同时利用EDU细胞增殖标记和流式细胞仪对其功能进行探索.[结果]BmGcm(BGIBMGA006182)定位于4号染色体的nscaf2847上,其基因全长4046 bp,包含4个外显子和3个内含子.其cDNA全长1734 bp,包含166 bp的5′UTR、227 bp的3′UTR和1341 bp的完整开放阅读框(ORF).该基因编码446个氨基酸残基,预测蛋白分子量为50.61 kD,等电点5.557,含有典型的GCM结构域.多重比对结果显示GCM结构域在不同物种间具有高度的保守性,进化分析显示昆虫Gcm蛋白单独聚为一支,其中BmGcm蛋白与帝王蝶同源蛋白亲缘关系最为接近.表达分析结果显示BmGcm在胚胎发育第4天表达达到峰值,随后表达水平逐渐下调,而在幼虫阶段,BmGcm主要表达于中肠、精巢和卵巢.将BmGcm完整的开放阅读框序列构建至原核表达系统,经IPTG诱导和亲和层析纯化获得高纯度重组蛋白,通过免疫小鼠获得了多克隆抗体,Western blot检测该抗体可以特异性识别重组蛋白.在家蚕细胞系中过表达BmGcm蛋白,结果显示其定位于细胞核.在细胞水平,过表达BmGcm会明显抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞于G1/S期.[结论]克隆鉴定得到Bmgcm全长序列,获得其表达和亚细胞定位信息.通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠制备了可用的多克隆抗体.细胞实验发现BmGcm可以显著抑制增殖和影响正常的细胞周期进程.

关键词：家蚕glialcellmissing基因(BmGcm)、克隆、表达分析、抗体制备、过表达

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资助基金：国家自然科学基金31672496;中国博士后科学基金2017M620408;重庆市自然科学基金cstc2016jcyjA0425;重庆市高校创新团队建设计划CXTDX201601010

在线出版日期：2018-06-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：1401-1411