番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

摘要：

[目的]从番茄中克隆高效转录的S1U6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础.[方法]采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种S1U6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的S1U6启动子驱动GUS的植物融合表达载体.利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的S1U6-2启动子.采用DNA重组技术构建以S1U6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因ML01和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体.载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型.利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性.[结果]经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框.成功构建了8个S1U6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体.番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个S1U6启动子均具有转录活性.选择S1U6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因ML01和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子S1U6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑.内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区.[结论]成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的S1U6启动子;基于S1U6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑.

关键词：CRISPR/Cas9、S1U6启动子、克隆、番茄、基因编辑

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资助基金：国家自然科学基金31560534

在线出版日期：2018-03-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：315-326