美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质

摘要：

[目的]研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标.[方法]对家蚕(Bombyx mori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的凡丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长cDNA序列;构建原核重组表达载体pET30a-HcCDA2,克隆获得编码美国白蛾HcCDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体pFastBac-HcCDM和pFastBac-HcCDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾HcCDA1(前期研究所得)和HcCDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白HcCDA1和HcCDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶HcCDA1&2的酶活力,对其最适反应温度、最适pn以及金属离子的影响等酶学性质进行研究.[结果]获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长cDNA序列,命名为fHcCDA2 (GenBank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得HcCDA2蛋白的特异性多克隆抗体.Western blot分析结果表明,HcCDA1和HcCDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 kD蛋白.酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的HcCDA1和HcCDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为5 0℃,当温度达到80℃时,HcCDA2几乎失去酶活力;HcCDA1酶促反应适宜的pH范围为7.0-9.0,并且HcCDA1和HcCDA2酶促反应的最适pH均为8.0;在最适反应条件下,HcCDA2蛋白酶活力均高于HcCDA1蛋白酶活力;Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ca2+对HcCDA1和HcCDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn2+对HcCDA1抑制作用逐渐增强,而Mg“对HcCDA1的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势,而且Mg2+和Ca2+对HcCDA2的抑制作用也是呈现先升高后降低的趋势.Co2-和Fe2+对HcCDA1和HcCDA2酶促反应有激活作用,随浓度增大,Fe2+激活作用越强,而Co2+激活作用则呈现先升高后降低的趋势.[结论]克隆了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因(HcCDA2),在原核细胞中表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得HcCDA2蛋白的特异性抗体.得到具有活性的美国白蛾几丁质脱乙酰酶HcCDA1和HcCDA2,两者在体外均检测到催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,最适pH均为8.0.

关键词：美国白蛾、几丁质脱乙酰酶、克隆表达、酶学性质

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分类号：S8 ;S76

资助基金：国家自然科学基金31471775;国家现代农业花生产业技术体系30971910;北京市百千万人才工程项目

在线出版日期：2017-05-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：849-858