奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控

摘要：

[目的]固醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用.论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础.[方法]以荷斯坦奶牛乳腺组织的cDNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pcDNA3.1载体进行重组环化构建pcDNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞.以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因mRNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0tg pcDNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pcDNA3.1-SREBP1载体,分析pGL3-SCD 2和pGL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系.[结果]分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pcDNA3.1载体重组后获得pcDNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pcDNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Rea1-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的mRNA表达倍数增强130.4倍(Ｐ＜0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与pGL3-SCD1、pGL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加pGL3-SCD3、pGL3-CD4启动子的活性(P＜0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25-1 μg的pcDNA3.1-SREBP1处理后,与pGL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,pGL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43 (P＜0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列.[结论]克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录.

关键词：奶牛、固醇调节元件结合蛋白1、乳腺上皮细胞、亚细胞定位、转录调控

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分类号：S85;R5

资助基金：国家“973”项目2011CB100802;国家自然科学基金31072009;国家转基因重大专项2014ZX0801015B;河南省高等学校重点科研项目15A230020;河南省基础与前沿项目162300410258

在线出版日期：2017-04-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：4797-4805