柑橘全爪螨PcSOD3的异源表达及其重组酶的抗氧化活性

摘要：

[目的]笔者课题组前期研究发现,柑橘全爪螨在极端温度、杀螨剂、重金属和紫外线胁迫下,其体内PcSOD3表达显著上调,暗示PcSOD3了在柑橘全爪螨应对不良环境胁迫的过程中起着至关重要的作用.为了进一步明确PcSOD3的生理功能,本研究开展了该基因的异源表达及重组酶生化特性的分析工作.[方法]构建pET28a-PcSOD3重组表达质粒,并在大肠杆菌中实现异源表达.随后利用镍柱亲和层析法分离纯化PcSOD3重组酶,采用Western blot对纯化蛋白进行验证.使用WST-1法分析PcSOD3重组酶的抗氧化活性,测定不同反应体系pH及不同前处理温度下PoSOD3重组酶的活性.采用氯化铬、叔丁基过氧化氢和过氧化氢异丙苯3种氧化性药剂,诱导大肠杆菌细胞内产生氧化应激反应,并利用Kirby-Bauer纸片琼脂糖扩散法测定上述3种药剂对过表达PcSOD3大肠杆菌的抑制效果.[结果]在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中成功表达PcSOD3,研究摸索出PcSOD3重组蛋白最适诱导表达条件:诱导表达温度为18℃,摇床转速为160r/min,当OD值达0.6时加入IPTG并使其终浓度为0.4mmol·L-1,诱导时间为18h.Western blot验证结果表明所纯化重组蛋白即为PcSOD3重组酶,重组蛋白大小为25.3kD. WST-1法测得PcSOD3重组酶活性在pB=7.0的反应体系中最高,约为47.3 U/mg protein,而在前处理温度为25℃时,PcSOD3重组酶活性最高为40.2 U/mg protein.利用K-B纸片琼脂糖扩散法进行了药敏试验,结果显示氯化铬对过量表达PcSOD3大肠杆菌产生的抑菌圈均显著小于对空载体对照产生的抑菌圈,通过测量发现抑菌圈较对照缩小近20％;在150 mmol·L-1浓度下叔丁基过氧化氢对过量表达PcSOD3大肠杆菌产生的抑菌圈与对照相比缩小约25％;而浓度为200 mmol·L-1的过氧化氢异丙苯对过量表达PcSOD3大肠杆菌产生的抑菌圈与对照相比则缩小约15％.[结论]成功在大肠杆菌中实现了PcSOD3的功能性表达,并纯化获得了PcSOD3重组蛋白.明确了PcSOD3重组酶最适反应pH及最适前处理温度等生化特性,WST-1法证明PcSOD3重组蛋白在离体条件下具有显著的抗氧化活性,而K-B纸片琼脂糖扩散法则证明过表达PcSOD3的大肠杆菌抗氧化能力显著增强,说明PcSOD3具有抗氧化功能.研究结果进一步揭示PcSOD3在柑橘全爪螨抗氧化损伤过程中具有重要作用.

关键词：柑橘全爪螨、超氧化物歧化酶、生化特性、重组蛋白、药敏试验

所属期刊栏目：49

分类号：S47;R96

资助基金：国家自然科学基金面上项目31572016;重庆市科委社会民生项目cstc2015shmszx80008;西南大学博士基金SWU115017

在线出版日期：2017-04-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：4735-4744