蝗虫微孢子虫套式PCR检测方法的建立及应用

摘要：

[目的]建立一种灵敏、快捷的检测蝗虫微孢子虫(ParanoSema locus tae)的套式PCR方法,为运用微孢子虫防治蝗虫提供技术支持.[方法]以GenBank数据库中公布的保守性高的微孢子虫小核糖体亚单位RNA为目的基因,采用PrimerSelect软件设计两对特异的套式PCR引物P.L.-F1/P.L.-R1和P.L.-F2/P.L.-R2,将微孢子虫液用0.2 mol.L-1 KOH处理后得到的发芽液作为模板进行PCR扩增,建立以P.L.-F1/P.L..-R1为外侧引物、P.L.-F2/P.L.-R2为内侧引物的套式PCR,扩增产为分别为298和242 bp.对引物浓度、退火温度及循环数进行优化,建立套式PCR方法,以此方法对梯度稀释的微孢子虫液进行灵敏性检测,并对采自哈密地区巴里坤北山的蝗虫样品进行检测.同时对提取的微孢子虫液进行传统的显微镜检测,并比较两种方法的灵敏度.[结果]建立了蝗虫微孢子虫的套式PCR快速特异性检测方法,优化后的PCR反应体系均为20μL:Buffer(10×)2.0 μL,dNTPs(10mool·L-1)0.3ul,Taq DNA酶(250 U)0.3 μL,上、下游引物(10umol·L-1)各0.3μL,微孢子虫发芽液(第2轮以第1轮产物10x稀释液为模板)1ul,加水补充至20μL;PCR反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,第1轮60℃退火(第2轮62℃退火)30 s,72℃延伸20 s,共35个循环;72℃延伸10 min,10℃保存.灵敏度试验显示,检测的微孢子虫数量可以达到12.2个孢子/μL(DNA量为1.07 pg·ul-1).应用建立的套式PCR方法,对采自新疆哈密地区巴里坤北山的240头蝗虫样品进行了微孢子虫检测,检测结果为23.3％的阳性,而显微镜检测结果阳性仅为3.8％.[结论]研究建立的套式PCR方法能够快速特异地检测蝗虫微孢子虫的感染,为蝗虫微孢子虫致病性研究及田间应用提供了技术支持.

关键词：蝗虫微孢子虫、套式PCR、检测

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资助基金：新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目2014211A042

在线出版日期：2017-01-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：4239-4245