棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

摘要：

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的 cDNA 序列，并利用原核表达系统高效表达融合蛋白，检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸（L-Cit）和L-精氨酸（L-Arg）含量的影响，为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶cDNA序列作为探针，利用电子克隆和RT-PCR技术，从棉花幼叶中获得cDNA片段，T/A克隆测序后得其序列信息，利用生物信息学软件分析其 DNA 结构、蛋白质结构、功能域和同源性，并构建系统进化树。利用 qRT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式；将 GhASS1的开放阅读框连接到原核表达载体 pCold-TF 上，构建融合表达载体pCold-GhASS1，转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量，焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力，HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量，对比不同温度和不同NaCl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花GhASS1存在于D基因组的第1染色体上，由10个外显子和9个内含子构成，其cDNA全长序列共1584 bp，其中5′非翻译区22 bp，开放阅读框1485 bp，3′端非翻译区77 bp，编码产物由494个氨基酸组成，推断分子量为54 kD，等电点6.74；序列比对分析表明GhASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%，且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序；系统进化分析显示GhASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近，而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远；盐胁迫可上调叶片中GhASS1的表达，1 d时达到峰值，随后逐渐下降，推测GhASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体pCold-GhASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 kD，与预期相符，在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性；与对照菌相比，pCold-GhASS1工程菌中游离L-Cit含量下降，L-Arg含量上升，且在生长周期中较快进入对数生长期；在含高浓度NaCl的培养基中pCold-GhASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值，显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因 cDNA 序列GhASS1，推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。

关键词：棉花、精氨琥珀酸合成酶基因、耐盐胁迫、real-time PCR

所属期刊栏目：49

分类号：Q78;R329.28;Q5

在线出版日期：2016-05-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：24-35