鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率

摘要：

【目的】针对禽类干细胞研究中，存在转染效率与干涉效率低下的问题，通过比较不同干涉方式对鸡原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）中Piwi基因的干涉效果，探讨提高禽类生殖干细胞干涉效率的有效方法。为进一步研究Piwi基因参与干细胞自我更新、RNA沉默以及转录后调控过程等生物学功能研究奠定基础。【方法】根据已建立的原代细胞分离技术，分别从健康鸡群的10日龄和4日龄鸡胚中分离成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF）与生殖脊，其中CEF作为PGCs细胞的饲养层，生殖脊经Trypsin-EDTA室温下消化获得PGCs细胞，并通过形态学、化学方法（PAS糖原染色、AKP 活性检测）和免疫学方法（TERT抗体、SSEA-1抗体）对其进行鉴定。根据Genbank公布的鸡Piwi基因的mRNA序列（NM_001098852），利用在线软件分别靶向不同位点设计合成得到3个小片段的stealth siRNAs，并将通用无义序列BLOCK-iTTM Alexa Fluor? Red Fluorescent Oligo作为荧光素标记的阴性对照 siRNA。同时，在线设计三条干扰序列和一条非特异性阴性对照序列，将其插入线性化空载体 pRNA-U6.1，构建不同的shRNA干涉载体。分别采用不同类型的转染试剂将构建好的siRNA和shRNA转染PGCs细胞。首先利用通用无义siRNA以及仅带有GFP荧光标记基因的shRNA载体作为阴性对照，检测siRNA和shRNA转染效率，确定最佳转染条件。其次，将试验组siRNA和shRNA在优化条件下转染PGCs细胞，分别收集转染了24、48、72和144 h这4个时间点的细胞，提取各个时间段的总RNA，采用实时荧光定量PCR技术检测Piwi基因mRNA表达水平，并用SPSS软件分析不同处理组的差异。【结果】在对原代分离的PGCs细胞进行了形态学、化学以及免疫学方法鉴定后，确认其所获得的细胞为PGCs细胞且状态良好。根据不同的转染试剂量与siRNA或shRNA载体量的配比，得出siRNA转染最优条件为siRNA﹕LipofectamineTM 2000=50 pmol﹕2μL； shRNA转染最优条件为shRNA﹕X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng﹕1.5μL。在以上最优转染条件下，将试验组siRNA和shRNA分别转染第二代PGCs细胞。发现在siRNA干涉组中，阴性siRNA组和空白组相比，Piwi基因表达量在24、48、72和144 h差异均不显著（P＞0.05）；而3个试验组siRNA与阴性对照组相比，在24、48和72 h的Piwi基因表达量均呈现显著下降（P＜0.05），但在144 h时表达差异不显著（P＞0.05）。在shRNA干涉组中，空白组和阴性对照组相比，Piwi基因表达量在4个时间点上差异均不显著（P＞0.05）；而3个试验组与阴性对照组相比，Piwi基因表达量在4个时间点上均显著下降（P＜0.05）。与siRNA干涉试验组相比，shRNA 载体表现出更强及更长时间的稳定抑制Piwi基因的效果。【结论】siRNA与shRNA均能较好抑制目的基因的mRNA表达，不同干涉效果表明采用shRNA 载体具有更好及更长时间的抑制作用，这为RNAi技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提供基础资料。

关键词：Piwi 基因、siRNA、shRNA、PGCs、RNAi

分类号：R32;S85

资助基金：国家自然科学基金31372297，31301966;国家科技支撑计划项目2015BAD03B03

在线出版日期：2016-04-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：563-572