Sall4表达调控及其启动子核心调控区的筛选

摘要：

[目的]Sa114是一种锌指结构转录因子,对建立和维持动物多能干细胞具有重要意义.为探索猪Sa114的表达和转录调控机制,克隆了猪Sa114启动子,对其进行了功能验证和核心调控区的筛选.[方法]从猪基因组中克隆获得2.1 kbSa114启动子片段,并构建相应的报告载体;将报告载体pE2.1转染不同种类的细胞,进行细胞特异性表达检测;采用实时荧光定量PCR方法,检测Sa114在猪不同组织和细胞中的表达变化;通过生物信息学方法,分析Sall4启动子上各种关键顺式作用元件和潜在的转录结合位点;将多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b和Smad与Sa114启动子共转染293T细胞,利用双萤光素酶报告系统检测Sa114启动子活性;采用DNA片段缺失的方法,构建一系列Sa114启动子片段缺失报告载体,将缺失片段载体分别转入293T细胞中,并利用双萤光素酶报告系统检测启动子的活性.[结果]Sa114在多能干细胞、生殖细胞和癌化肿瘤细胞中:包括P19、293T、CHO和Hela等细胞中特异性高表达.另外,通过实时荧光定量PCR检测结果显示,Sa114的表达具有明显的组织特异性,其在猪iPS细胞和生殖相关组织,如睾丸和卵巢组织中表达最高,而在脑、心、肝和肌肉等组织中的表达较低,表明该基因与细胞多能性维持具有互作关系.应用JASPAR和GPMiner软件分析发现,Sa114启动子上有TATA box、GC box、ChAT box等顺式作用元件,以及Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b、Stat3和Smad等多能转录因子的预测结合位点.其中,Oct4、Sox2和TGF-beta信号通路因子对Sa114启动子活性有较显著的激活作用,与对照组比较Sa114启动子活性提高了3倍;而Klf4因子对Sa114启动子活性有一定的抑制作用.采用分段PCR的方法,对2.1kb启动子进行了片段缺失,分别构建了pL2.1、pL1.0和pL0.5等3个报告载体,检测结果发现,在pL2.1与pL1.0之间相差1 kb左右,但是启动子的活性没有显著差异.载体pL1.0与pL0.5之间多了486 bp片段,启动子活性提高了1倍多.另外,pL0.5的启动子活性与对照组比较提高了8倍.这些结果表明,猪Sall4启动子在-367至-852 bp和-1至-366 bp两个区域内存在核心调控区.[结论]克隆了猪Sall4启动子,证明Sa1l4的表达具有明显的组织特异性;Sall4启动子序列上存在众多潜在的转录因子结合位点和启动子核心调控域,是参与调控Sall4表达的重要序列,这些转录因子与Sall4相互作用对Sall4在多能细胞中的表达调控发挥重要作用.

关键词：猪、Sall4、启动子、多能性、转录调控

所属期刊栏目：49

分类号：S852.65;R735.1;Q78

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金

在线出版日期：2016-06-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：176-185