多能性转录因子mRNA转染山羊胎儿成纤维细胞条件优化

摘要：

【目的】为了优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast，GEF）的条件，本试验针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究。【方法】采用胰酶消化法，从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据mMESSAGE mMACHINE? T7 Ultra Kit试剂盒说明书，体外转录步骤主要有：①前期的质粒准备：首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取，随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切，获得线性化质粒，最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化；②mRNA的“加帽”：以线性化DNA为模板，合成带有5′端帽子结构的mRNA，添加TURBO DNase以除去模板DNA；③mRNA的“加尾”：以ATP为原料，利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶，对已经“加帽”的mRNA进行“加尾”，以合成结构完整的mRNA；④完整mRNA的纯化：按照MEGAclearTM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后，将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA（EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg）和脂质体2000的比例为1?0.5、1?1.0、1?1.5、1?2.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测，并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组（P＜0.05），且本组细胞在形态和生长方面相对较好；免疫荧光检测表明，4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核，并获得稳定表达，在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达；GEF细胞在转染4种mRNA 24h后，细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢；细胞活力低于对照组（山羊成纤维细胞正常生长组）。【结论】GEF细胞在总mRNA和脂质体2000的比例为1?1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF的条件下更适合mRNA的转染。研究工作为mRNA转染体细胞或干细胞的研究及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）的获得提供参考资料，并对mRNA在成纤维细胞中的去向提供间接证据，有利于更加深入地了解多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA相关功能。

关键词：mRNA、转染、山羊胎儿成纤维细胞、转录因子

分类号：S81;R32

资助基金：转基因生物新品种培育重大专项2011ZX08008-003;江苏高校优势学科建设工程资助项目

在线出版日期：2016-01-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：4159-4169