大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系的建立

摘要：

【目的】建立适合于大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）致病性相关突变体的快速筛选体系，为突变库中与致病性相关突变体的系统筛选和鉴定提供技术支撑。【方法】棉花幼苗接种于5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107和5.0×108孢子/mL的孢子悬浮液30 min，通过病情指数调查明确引起棉花黄萎病发生的病原菌浓度范围；对培养于培养瓶的大丽轮枝菌分别加入15、25、35和45 mL的灭菌水，利用血球计数板检测洗脱的孢子浓度，明确不同体积灭菌水对洗脱孢子悬浮液浓度的影响；以保存于96孔板的突变体为单位，在培养皿上进行单孢分离并挑取单个孢子于培养瓶中扩繁培养，培养后于培养瓶中直接加入适宜体积灭菌水洗脱孢子，并将棉花幼苗直接置于含有孢子悬浮液的培养瓶中处理30 min，接种后继续培养14 d并调查结果；致病性相关突变体的可靠性检验采用定量菌液蘸根接种法，每个突变体接种30株棉花幼苗，3个重复，孢子浓度为5.0×106孢子/mL，每株棉花幼苗按接种5 mL菌液计算，处理30 min，分别在第5、8、11和14天调查病情指数。【结果】明确了适合于大丽轮枝菌致病力快速鉴定的接种孢子浓度为＞5.0×105孢子/mL；建立了大丽轮枝菌培养方法，单孢纯化培养5 d，培养瓶中扩大培养9 d，确定了快速定量制备孢子悬浮液的洗脱体积为25 mL，测试的20个突变体的洗脱孢子浓度范围在（2.55±0.58）×106—（1.72±0.25）×107孢子/mL；优化了单孢分离、扩大培养、孢子悬浮液制备、接种、继续培养和结果统计等环节，建立了大丽轮枝菌致病性快速鉴定流程，进一步统筹设计构建了大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系；测试表明该体系1人1个循环共7个流程可完成1344个突变体筛选，周期54 d，工作量为21人日；采用定量菌液蘸根法重复验证结果，突变体致病力同样显著下降，与快速筛选体系的鉴定结果一致，表明该体系适用于大丽轮枝菌致病性相关突变体的快速筛选。【结论】通过棉花幼苗种植、突变体单孢分离、扩繁培养、孢子悬浮液制备、接种、结果统计等环节的优化和标准化，构建了适合于大丽轮枝菌致病性相关突变体的快速筛选体系，为后续致病相关基因的分离提供了技术支撑。

关键词：大丽轮枝菌、致病性相关突变体、致病性鉴定、快速筛选体系

分类号：S432.2+3;S562;S634.1

资助基金：国家重点基础研究发展计划（973计划）;国家自然科学基金

在线出版日期：2015-09-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：2747-2756